[發明專利]轉分化的方法和其使用方法

有效

• 申請號: 201580077116.8
• 申請日: 2015-12-30
• 公開（公告）號: CN107750170B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: S·費貝爾
• 申請（專利權）人: 奧爾吉尼西絲有限公司;特拉哈斯霍默-醫學研究;基礎設施和服務有限公司
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;C12N15/09;C12N15/861;C12N5/10;A61P3/10;A61P5/48;C12N15/63
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 區斌

1.一種制造人類胰島素產生細胞的群體的體外方法，所述方法包括以下步驟：

（a）處理成人肝組織以回收原代成人肝細胞；

（b）使所述原代成人肝細胞繁殖和擴增到預定的細胞數；

（c）將所述擴增的細胞轉分化，其中所述轉分化包含：

（1）用至少一種表達載體感染所述擴增的細胞，所述感染發生在第一時間段，

（i）其中所述至少一種表達載體包括含有編碼PDX-1多肽的核酸的腺病毒載體，以及含有編碼人類第二胰腺轉錄因子多肽的核酸的腺病毒載體，其中使用所述腺病毒載體的所述感染發生在同一時間；

或

（ii）其中所述至少一種表達載體包括含有編碼人類PDX-1多肽和第二胰腺轉錄因子多肽的核酸的腺病毒載體；

以及

（2）用包含編碼MafA多肽的核酸的腺病毒載體感染（1）的所述擴增的受感染的細胞，所述感染發生在第二時間段；以及其中所述第二時間段在所述第一時間段之后；以及

（d）收獲所述轉分化的擴增的細胞；

從而制造所述人類胰島素產生細胞的群體，其中所述成人肝細胞表達間充質干細胞標志物并且不經歷其中所述細胞包含胚胎特征的階段，

其中所述人類胰島素產生細胞的群體具有

與對照非轉分化原代成人肝細胞相比，增加的胰島素含量，或增加的葡萄糖調節的胰島素分泌，或增加的葡萄糖調節的C肽分泌，或增加的內源Nkx6.1轉錄因子的表達，或其任何組合，

其中所述胰島素產生細胞表達間充質干細胞標志物且不包含胚胎特征，并且

其中所述第二胰腺轉錄因子選自NeuroD1和Pax4。

2. 權利要求1所述的方法，其中所述繁殖和擴增包含使用生物反應器。

3.如權利要求1所述的方法，其中步驟(a)的所述人肝組織包含

從患有胰腺病癥或胰島素依賴性糖尿病的受試者獲取的肝組織。

4. 如權利要求2所述的方法，

a. 其中所述生物反應器包含單個生物反應器或多個生物反應器；或

b. 其中所述生物反應器包含單次使用生物反應器、多次使用生物反應器、封閉系統生物反應器、或開放系統生物反應器、或其任意組合；

或其任意組合。

5.如權利要求2-4中任一項所述的方法，其中在步驟（c）中，所述擴增的細胞的所述轉分化包括經由一系列生物反應器系統進行轉分化。

6.如權利要求1-4中任一項所述的方法，還包括富集所述原代成人肝細胞中傾向于轉分化的細胞的步驟，其中所述富集步驟在所述轉分化步驟之前或與所述轉分化步驟同時進行，或兩者都有。

7.如權利要求6所述的方法，其中所述原代成人肝細胞中傾向于轉分化的細胞包含以下細胞：

（a）含有活性Wnt信號轉導通路；

（b）具有激活谷氨酰胺合成酶響應元件的能力；

（c）當所述細胞包含肝細胞時，具有增加的HOMER1、LAMP3、BMPR2、ITGA6、DCBLD2、THBS1、或VAMP4、或其任意組合的表達；

（d）當所述細胞包含肝細胞時，具有降低的ABCB1、ITGA4、ABCB4、或PRNP、或其任意組合的表達；或

其任何組合。

8.如權利要求1-4中任一項所述的方法，還包括在所述原代細胞中增加Wnt信號激活的步驟。

9.如權利要求1-4中任一項所述的方法，所述方法還包括將所述原代成人肝細胞與鋰一起孵育。

10.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述預定的細胞數為10-20億個細胞。

11.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中間充質干細胞標志物包括CD73、或CD90、或CD105、或CD44，或其任意組合。