[發明專利]干細胞材料及制備方法

在審

• 申請號: 201580074529.0
• 申請日: 2015-11-30
• 公開（公告）號: CN107429228A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 阿納托利·安德烈耶維奇·索科洛夫;安東寧娜·伊瓦諾芙娜·科列斯尼科娃;安德烈·伊戈列維奇·多夫吉
• 申請（專利權）人: 輔助性T細胞技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/02;A61K38/18;A61K35/28;A61P17/02
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司11240
• 代理人: 張英

技術領域

與本發明實施例一致的組合物和方法通常至少涉及細胞生物學、分子生物學和醫學領域。更具體地說，本發明實施例涉及干細胞、干細胞條件培養基、獲得干細胞條件培養基的方法以及干細胞和干細胞條件培養基的用途。

背景技術

間充質干細胞(MSC)是可能分化為間充質細胞類型(例如，脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞)的多潛能基質細胞。MSC具有很強的自我更新能力，同時保持其多潛能性。骨髓MSC目前正在臨床試驗中應用于各種治療。分離、純化和復制培養物中的MSC的方法在本領域中是眾所周知的。

可以使用磁珠，在單層(即二維)或三維系統中培養MSC。這些標準方法可以使MSC在與其生理環境極為相似的條件下生長。已證明MSC行為在體內和體外環境中可能不同。不同MSC細胞系之間的差異通常可歸因于分離技術和體外培養條件的差異。例如，生長條件的變化可影響體外細胞行為，包括影響細胞表面標志物的表達。細胞表面特異性標志物的表達可用于區分不同細胞系或確認細胞系的譜系。

所有細胞(包括MSC)在培養過程中可產生生物制品。例如，已知MCS在培養過程中產生超過200種獨特的蛋白質。MSC在培養過程中產生的特定生物制品可用于表征和區分不同MSC。然而，即使使用相同來源的MSC，分離技術和體外培養條件的差異也可影響和改變分泌生物制品的產生。當然，還知道偏離理想的細胞生長條件可能導致培養物的衰老和損失。

發明內容

根據本發明的其中一個方面，提供了一種來自Wistar大鼠的骨髓的獨特的間充質干細胞系，其具有一個或多個特定特征。例如，當將0.7×10⁶個細胞接種到75cm²培養瓶中并培養至少96小時時，間充質干細胞系可以：(a)在更換培養基后24小時內，產生至少4.5mM乳酸鹽；(b)在更換培養基后24小時內，產生至少150pg/ml的GRO/KC；(c)在更換培養基后24小時后，產生低于250pg/ml的OPG；或者(d)在更換培養基后24小時后，產生低于80pg/ml的TGF-β3。根據本發明的另一個方面，當將0.7×10⁶個細胞接種到75cm²培養瓶中并培養至少150小時時：(e)在更換培養基后24小時內，培養基的pH值降至7.0以下；或者(f)在更換培養基后24小時內，培養基的pH值與不含細胞的培養基的pH值相比下降至少0.4個單位。培養基可以是補充有5％CO₂的RPMI-1640培養基。此外，相同干細胞系在pH值低于7.05時，至少能進行一次群體倍增。干細胞系的特征還表現為CD29和CD44標志物的表達呈陽性以及CD11b和CD45標志物的表達呈陰性。

本發明的一個單獨方面涉及一種條件培養基，該培養基可以通過將培養基中的多個獨特干細胞保持在特定的調節期進行制備。一方面，培養基是補充有5％CO₂的RPMI-1640。細胞可以在各種條件(包括大氣中的CO₂濃度或缺氧條件下)下保持在培養基中。根據本發明的該方面，調節期可能不同。例如，調節期可以為至少12小時，也可以為足以使條件培養基含有至少150pg/mL GRO/KC的時間段。在本發明的另外一個方面中，條件培養基可以至少包含以下一種產物：(a)至少500pg/mL的GRO/KC；(b)至少4000pg/ml的VEGF；(c)低于250pg/ml的OPG；或者(d)低于80pg/ml的TGF-β3。

本發明的另外一個方面涉及一種包含獨特干細胞系或由獨特細胞調節的培養基的組合物。組合物還可以包括合適的載體。載體可以包括液體、乳膏劑、氣霧劑、洗劑、軟膏劑、水凝膠，但并不限于此。在本發明的某些方面，可以對組合物進行處理，以除去部分或全部干細胞。在另外一個方面，組合物可以包含低于250pg/mL OPG或低于80pg/ml TGF-β3的條件培養基。

根據本發明的各個方面，獨特的干細胞系、條件培養基或組合物可以通過注射、植入或通過局部應用給予受試者。根據本發明的其他方面，可將細胞、條件培養基或組合物應用于縫線、繃帶、針織網、植入物、支架、移植物、濕巾、牙周墊或其他給藥器械。細胞、條件培養基或組合物具有多種用途，包括，例如燒傷治療、皮膚護理、血管生成、血管發生、器官或組織愈合、化妝品、組織炎癥、細菌感染、傷口應用、糖尿病、制藥和眼科應用、減輕疤痕、刺激毛發生長、免疫治療應用和免疫修復治療、皮膚、骨髓或器官移植、器官或組織治療，或用于治療人或動物的其他疾病。

附圖說明