[發(fā)明專利]用于檢測高毒力艱難梭菌菌株的存在的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580069412.3
• 申請日: 2015-12-18
• 公開（公告）號: CN107110864B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: J.基爾維斯卡里;J.庫爾克拉
• 申請（專利權(quán)）人: 分子診斷有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 張文輝

本發(fā)明提供了在生物樣品中檢測高毒力艱難梭菌菌株的基于核酸擴(kuò)增的方法。本發(fā)明基于對高毒力艱難梭菌基因組中陰性和陽性標(biāo)志物特異的寡核苷酸引物和探針的用途。

本發(fā)明涉及基于核酸擴(kuò)增的診斷測定領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了在生物樣品中(如糞樣品中)檢測高毒力艱難梭菌菌株(優(yōu)選為毒素生產(chǎn)性艱難梭菌菌株027)的基于PCR的方法。本發(fā)明基于對高毒力艱難梭菌菌株中陰性和陽性標(biāo)志物特異的寡核苷酸引物和探針的用途。

發(fā)明背景

艱難梭菌感染(CDI)是一種毒素介導(dǎo)的腸道疾病。CDI的臨床結(jié)果可以從無癥狀定殖(colonization)變化到更嚴(yán)重的疾病綜合征，包括嚴(yán)重腹瀉，腹痛，發(fā)燒和白細(xì)胞增多。艱難梭菌被認(rèn)為是住院治療和抗生素治療后患者發(fā)生的感染性腹瀉的主要原因。因此，CDI現(xiàn)在被認(rèn)為是最重要的保健相關(guān)感染之一。此外，還出現(xiàn)了非醫(yī)院相關(guān)的艱難梭菌庫(reservoirs)，并且艱難梭菌能夠在動物宿主中傳播(Denéve et al.，2009；Rupnik etal，2009)。

目前，艱難梭菌檢測方法包括細(xì)胞毒素產(chǎn)生(cytotoxigenic)培養(yǎng)法、對由艱難梭菌產(chǎn)生的毒素A和毒素B檢測的細(xì)胞毒素測定(CYT)，對艱難梭菌tcdB基因檢測的基于PCR的測定，和對艱難梭菌特異性谷氨酸脫氫酶(GDH)檢測的測定(Eastwood et al.，2009)。

在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基于PCR的測試是快速篩選和鑒定含有艱難梭菌的樣品的可靠、靈敏和特異的診斷工具(Eastwood et al.，2009；Hirvonen et al.，2013；Houseret al.，2010和WO2012087135)。商業(yè)使用中的是由WO2010116290(Philips)公開的方法，其涉及通過分析細(xì)胞毒素tcdB基因以及tcdC基因中的缺失的存在或缺少來檢測產(chǎn)毒的艱難梭菌菌株的多重PCR測定。

雖然已經(jīng)公開了用于檢測毒素生產(chǎn)性艱難梭菌菌株的多個基于PCR的測定方法，但在本領(lǐng)域中仍然需要能夠?yàn)闄z測那些高毒力艱難梭菌菌株提供高特異性和可靠性的PCR測定。本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)在艱難梭菌基因組中定位了DNA序列區(qū)域，其令人驚訝地非常適合用于與高毒力艱難梭菌菌株相關(guān)的陰性和陽性標(biāo)志物的特異性和靈敏性擴(kuò)增。

樣品基質(zhì)(sample matrix)(其在腹瀉診斷中通常是糞或食物樣品)可能含有許多PCR抑制劑。這降低了PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率并因此對擴(kuò)增子設(shè)計步驟預(yù)期更為細(xì)致的優(yōu)化以驗(yàn)證所有模板和拷貝數(shù)被等量擴(kuò)增，但也足夠有效。因此，需要實(shí)現(xiàn)高PCR效率(最佳是盡可能接近100％)的寡核苷酸設(shè)計。所用的檢測方法還可以影響擴(kuò)增效率和/或偏愛。

本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)定位了DNA序列區(qū)域，該區(qū)域完全適合用于引起腹瀉的高毒力艱難梭菌菌株的特異性和靈敏性擴(kuò)增和定量。擴(kuò)增子被設(shè)計為是如此特異的，使得它們可以彼此組合成任何多重集合。自然地，這點(diǎn)的先決條件是所有公開的擴(kuò)增子也已被設(shè)計為在相同的反應(yīng)和循環(huán)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。本發(fā)明的目的是替代作為用于高毒力艱難梭菌篩選測試的抗原測試和培養(yǎng)，并因此通過快速提供豐富的信息集提供方法改善，實(shí)現(xiàn)在改善的患者管理中的實(shí)驗(yàn)室和臨床益處。此外，如果臨床微生物實(shí)驗(yàn)室能夠容易地區(qū)分非產(chǎn)毒的艱難梭菌和高毒力艱難梭菌，則感染控制能夠獲益。

發(fā)明概述

本發(fā)明的一個目的在于提供在生物樣品中檢測高毒力艱難梭菌菌株的存在的方法，所述方法包括：

進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其包含自所述生物樣品提取的DNA作為模板、在所述反應(yīng)中對于擴(kuò)增艱難梭菌hydR基因中目標(biāo)序列特異性的第一寡核苷酸引物組、和在所述反應(yīng)中對于擴(kuò)增對應(yīng)于SEQ ID NO：2所列的艱難梭菌序列的目標(biāo)序列的至少部分特異性的第二寡核苷酸引物組，其中所述hydR基因包含對應(yīng)于SEQ ID NO：1的序列。