[發(fā)明專利]靶向的RNA編輯

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201580069286.1
• 申請(qǐng)日: 2015-12-17
• 公開（公告）號(hào): CN107109413B
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: B·克萊恩;G·J·普拉滕伯格
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: ProQR治療上市公司Ⅱ
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113
• 代理公司: 北京尚誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 龍淳;周琴

使用寡核苷酸構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)RNA編輯，所述寡核苷酸構(gòu)建體包含(i)對(duì)于待編輯的靶核酸序列特異性的靶向部分和(ii)能夠結(jié)合和募集天然存在于細(xì)胞中的核酸編輯實(shí)體的募集部分。核酸編輯實(shí)體比如ADAR通過靶向部分被重定向到預(yù)先選擇的靶位點(diǎn)，從而促進(jìn)與靶向部分相對(duì)應(yīng)的靶RNA區(qū)域中的預(yù)先選擇的核苷酸殘基的編輯。

本申請(qǐng)要求英國(guó)專利申請(qǐng)1422511.4、1512467.0、1512595.8和1521987.6(分別于2014年12月17日、2015年7月16日、2015年7月17日和2015年12月14日提交)，其每個(gè)的全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考用于所有目的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明在RNA編輯領(lǐng)域中，由此對(duì)靶RNA序列的核苷酸序列進(jìn)行修飾例如以糾正突變。

背景技術(shù)

RNA編輯是一種天然的過程，通過這個(gè)過程，真核細(xì)胞通常以位點(diǎn)特異性和精確的方式改變RNA分子的序列，從而將基因組編碼的RNA的全部數(shù)量(repertoire)增加數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)。已經(jīng)描述了用于整個(gè)動(dòng)物和植物界的真核物種的RNA編輯的酶，并且這些過程在從最簡(jiǎn)單的生命形式比如秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)到人類的后生動(dòng)物中管理細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起重要作用。RNA編輯的實(shí)例是分別通過稱為腺苷脫氨酶和胞苷脫氨酶的酶的腺苷至肌苷以及胞苷至尿苷轉(zhuǎn)變。最廣泛研究的RNA編輯體系是腺苷脫氨酶。腺苷脫氨酶是包含識(shí)別結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的多結(jié)構(gòu)域蛋白。識(shí)別結(jié)構(gòu)域識(shí)別特定的dsRNA序列和/或構(gòu)象，而催化結(jié)構(gòu)域通過核堿基(nucleobase)的脫氨基作用在靶RNA附近或多或少預(yù)定的位置將腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤铡Ｍㄟ^細(xì)胞的翻譯裝置將肌苷讀作鳥嘌呤，這意味著如果編輯的腺苷在mRNA或mRNA前體的編碼區(qū)中，則可以重新編碼蛋白質(zhì)序列。A至I轉(zhuǎn)變也可以發(fā)生在靶mRNA的5’非編碼序列中，在原始起始位點(diǎn)上游產(chǎn)生新的翻譯起始位點(diǎn)，這產(chǎn)生N-末端延長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。此外，A至I轉(zhuǎn)換可以發(fā)生在mRNA前體中的內(nèi)含子或外顯子的剪接元件中，從而改變剪接模式。作為這種RNA編輯的結(jié)果，可以包含或跳過外顯子。腺苷脫氨酶是稱為作用于RNA的腺苷脫氨酶(ADAR)的酶的廣大家族的一部分，包括人類脫氨酶hADAR1、hADAR2和hADAR3。

使用寡核苷酸來編輯靶RNA在本領(lǐng)域是已知的，例如，參見Montiel-Gonzalez等人(Proceedings of the National Academy of Sciences2013，2013年11月5日，第110卷，第45期，第18285-18290頁(yè))。作者描述了使用基因工程化的融合蛋白靶向編輯靶RNA，該融合蛋白包含hADAR1蛋白的腺苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域，與噬菌體λ蛋白N的所謂B-box結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。已將hADAR1的天然識(shí)別結(jié)構(gòu)域去除以消除天然ADAR的底物識(shí)別性質(zhì)，并由λN-蛋白的B-box識(shí)別結(jié)構(gòu)域代替。B-box是由N-蛋白B-box結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別的17個(gè)核苷酸的短鏈RNA。作者構(gòu)建了一種包含與用于編輯的靶序列互補(bǔ)的向?qū)NA部分的反義寡核苷酸，其通過N-結(jié)構(gòu)域-脫氨酶融合蛋白融合至用于序列特異性識(shí)別的B-box部分。作者巧妙地表明，向?qū)NA寡核苷酸如實(shí)地將腺苷脫氨酶融合蛋白引導(dǎo)至靶位點(diǎn)，導(dǎo)致靶RNA的gRNA定向的位點(diǎn)特異性A至I編輯。

所提出的方法的缺點(diǎn)是需要由噬菌體λN-蛋白的B-box結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因地融合至截短的天然ADAR蛋白的腺苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域而組成的融合蛋白。這需要用融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞(這是主要障礙)，或者用編碼工程化的腺苷脫氨酶融合蛋白的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，以在靶細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)在多細(xì)胞生物體中實(shí)現(xiàn)編輯時(shí)，比如在針對(duì)人類疾病的治療中，后者構(gòu)成不小的障礙。