[發明專利]采用分選酶的酶介導多肽綴合新方法

有效

• 申請號: 201580068354.2
• 申請日: 2015-12-14
• 公開（公告）號: CN107001447B
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: M·伯尼茨-杜拉特;P·克拉奇;M·沙特
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 凌立;黃革生

本文報道用于產生兩條多肽的酶促綴合產物的方法，包括：孵育含有氨基酸序列LPXTG(SEQ ID NO:20，其中X可以是任意氨基酸殘基)的第一多肽、在其N端具有寡聚丙氨酸A_m(m＝2(SEQ ID NO:26)、或3(SEQ ID NO:27)、或4(SEQ ID NO:28)、或5(SEQ ID NO:29))氨基酸序列的第二多肽、源自金黃色葡萄球菌分選酶A的具有分選酶活性的第三多肽，從反應混合物回收綴合物，從而產生兩條多肽的酶促綴合產物。

本文報道用于酶促肽鍵綴合兩個化合物的改進方法。

背景技術

分選酶A(SrtA)是將蛋白質共價附著至細菌細胞壁的膜結合酶。SrtA底物上的特異性識別基序是LPXTG，由此該酶在氨基酸殘基蘇氨酸和甘氨酸之間切割。肽聚糖上的識別基序是五甘氨酸基序。已顯示N端上的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足以支持SrtA反應(Clancy,K.W.等,Peptide science 94(2010)385-396)。反應通過硫酯酰基-酶中間體進行，該中間體通過來自寡聚甘氨酸的胺親核體的攻擊而分解，將肽聚糖共價連接至蛋白質底物，并再生SrtA。SrtA可以用于將化學合成的肽共價綴合至重組表達的蛋白質。

在WO 2010087994中，報道了用于連接的方法及其用途。Marvin,J.S.等(ActaPharmacol.Sinica 26(2005)649-658)報道了IgG樣雙特異性抗體的重組方法。Levary,D.A.等(PLoS one,6(2011)e18342.1-e18342.6)報道了分選酶A催化的蛋白質-蛋白質融合。在WO 2013/003555中，報道了用分選酶安裝點擊化學把手進行蛋白質連接。

Strijbis,K.等(Traffic 13(2012)780-789)報道了用分選酶在活細胞中進行蛋白質連接。他們已指出，依賴Ca²⁺的金黃色葡萄球菌(S.aureus)分選酶A在細胞內沒有功能，但不依賴Ca²⁺的動物釀膿鏈球菌(S.pyogenes)分選酶A在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和哺乳動物HEK293T細胞二者的胞質和內質網(ER)腔中都具有功能。

Levary,D.A.等報道了分選酶A催化的蛋白質-蛋白質融合(PLOS ONE 6(2011))。Madej,M.P.等(Biotechnol.Bioeng.109(2012)1461-1470)報道了將抗表皮生長因子受體抗體改造為單鏈型式，并通過分選酶A介導的蛋白質連接進行標記。Ta,H.T.等報道了酶促單鏈抗體標記作為心血管疾病中靶分子成像和細胞歸巢的通用方法(Cir.Res.109(2011)365-373)。Popp,M.等報道了產生和斷裂肽鍵——使用分選酶的蛋白質改造(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.50(2011)5024-5032)。在WO 2010/087994中，報道了用于連接的方法及其用途。WO 2010/099536中報道了對DOTA螯合物具有高親和力的改造蛋白質。

已將缺乏N端膜錨定基序的截短SrtA用于細胞表面蛋白質標記、供價蛋白質固定化及在蛋白質中摻入新功能。但是，如果使用等摩爾量的底物，SrtA介導連接的產率總是低于70％，因為反應是可逆的。另一個缺點是反應中間體的水解，其產生LPXT產物而不是預期產物。這在與SrtA長時間孵育時尤其有問題。雖然這意味著殘留在最終產物中的甚至小量SrtA可以隨時間推移而破壞它；但這對質量標準非常高的生物制品而言是個大問題。

已報道了阻斷分選酶的逆反應的不同努力。Yamamura,Y.等(Chem.Commun.47(2011)4742-4744)報道了通過在底物識別位點附近引入β-發夾，在連接位點附近誘導β-發夾結構來增強分選酶A介導的蛋白質連接。

Biswas,T.等(Biochem.53(2014)2515-2524)報道了通過原型分選酶A分選LPXTG肽、不變底物殘基在調節酶動力學中的作用及生產底物的構象特征。