[發(fā)明專利]永生化雞胚成纖維細(xì)胞

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580065670.4
• 申請日: 2015-12-03
• 公開（公告）號: CN107002044B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J.庫爾
• 申請（專利權(quán)）人: 英特維特國際股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N7/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 任曉華;萬雪松

本發(fā)明涉及永生化雞胚成纖維細(xì)胞，包含此類永生化細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，包含此類細(xì)胞的疫苗，用于在此類細(xì)胞上繁殖禽類病毒的方法，以及制備此類細(xì)胞和此類疫苗的方法。

本發(fā)明涉及永生化雞胚成纖維細(xì)胞，包含此類永生化細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，包含此類細(xì)胞的疫苗，用于在此類細(xì)胞上復(fù)制禽類病毒的方法，以及制備此類細(xì)胞和此類疫苗的方法。

出于疫苗生產(chǎn)目的的病毒繁殖需要易感宿主細(xì)胞的可用性。通常，根據(jù)所使用的病毒種類和宿主細(xì)胞的類型，這些宿主細(xì)胞將在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長。對于許多禽類病毒種類的繁殖，存在在含胚卵中繁殖的額外可能性。然而在實(shí)踐中，許多禽類病毒種類生長在原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)細(xì)胞上。(直接從動(dòng)物培養(yǎng)的細(xì)胞被稱為原代細(xì)胞)。此類原代CEF細(xì)胞對許多不同的病毒種類是易感的，并且此類病毒通常可以在這些細(xì)胞中生長至高滴度。經(jīng)常在CEF細(xì)胞上生長的病毒的實(shí)例是火雞皰疹病毒(HVT)、馬立克氏病病毒、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、減蛋綜合征病毒(EDSV)、呼腸孤病毒(RV)和火雞鼻氣管炎病毒(TRT)。

然而，使用CEF細(xì)胞有幾個(gè)缺點(diǎn)。它們具有相對較短的體外壽命，并且它們獲得自含胚的特定無病原體的卵，所以對于連續(xù)需求，其生產(chǎn)既非常費(fèi)力又非常昂貴。因此，期望建立禽類來源的細(xì)胞系來代替原代CEF細(xì)胞的使用。

對于本發(fā)明的目的，永生化的細(xì)胞系是源自多細(xì)胞生物體的細(xì)胞群體(在本情況下為CEF)，其通常不會(huì)無限增殖，但由于突變，已逃避正常細(xì)胞衰老并反而可以保持進(jìn)行細(xì)胞分裂。此類細(xì)胞已逃避持續(xù)只有有限數(shù)量的分裂周期的正常生長限制。

CEF細(xì)胞(CEF細(xì)胞系)的永生化形式原則上可以解決上面鑒定的問題，但此類細(xì)胞幾乎不可得。獲得此類細(xì)胞的一種方式是分離和生長原代CEF細(xì)胞并等待自發(fā)永生化事件發(fā)生。然而，對于禽類細(xì)胞，自發(fā)永生化是非常罕見的。因此，僅已報(bào)道過三種自發(fā)永生化的雞細(xì)胞系；DF-1 (美國專利US 5672485)，SC-1和SC-2 (Christman, S.A.等人,Dissertation Abstracts Int.65:4414 (2004) (ISBN 0-496-06882-2)。除了發(fā)現(xiàn)和分離自發(fā)永生化的CEF細(xì)胞會(huì)非常耗時(shí)的事實(shí)，還證明，此類永生化的CEF細(xì)胞可顯示非常不同的特征，諸如隨著時(shí)間推移可變的生長速率和p53水平，這取決于它們已具有的傳代次數(shù)(Christman, S.A.等人, FEBS letters 579:6705-6715 (2005))。然而，特別是對于疫苗生產(chǎn)目的，需要這樣的細(xì)胞系，其特征隨著時(shí)間推移保持相同，而無論傳代次數(shù)。FDA已經(jīng)表明，不鼓勵(lì)在已通過未知機(jī)制轉(zhuǎn)化的贅生性細(xì)胞中的最小純化的活的減毒病毒疫苗的開發(fā)(FDA; CBER Discussion on cell substrates；2000年5月12日)。因此，自發(fā)永生化的CEF細(xì)胞作為用于疫苗目的的病毒繁殖的細(xì)胞來源是不太期望的。

還有本領(lǐng)域已知用于細(xì)胞有意永生化的方法。此類方法的優(yōu)點(diǎn)是消除了一致性因素(coincidence factor)，已知其為目的在于自發(fā)永生化細(xì)胞時(shí)的嚴(yán)重障礙。對于非禽類細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，常用的獲得永生化細(xì)胞的方法依賴于用逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染原代細(xì)胞，或用包含逆轉(zhuǎn)錄病毒或至少逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)(LTR)序列和編碼DNA腫瘤病毒癌蛋白(諸如猿猴病毒SV40 T和t)的序列的DNA分子轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞。

SV40 T和t在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)和p53蛋白的失活中起作用。Deepika Ahuja等人關(guān)于編碼大T和t的SV40 T的綜述論文提供了這些蛋白的作用機(jī)制的見解(Oncogene 24:7729-7745 (2005))。基本上，SV40 T基因產(chǎn)物T和t抑制腫瘤抑制因子的p53和Rb家族。

LTR是包含逆轉(zhuǎn)錄病毒基因表達(dá)所需的以下所有信號的逆轉(zhuǎn)錄病毒元件：增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化信號。