[發明專利]永生化雞胚成纖維細胞

有效

• 申請號: 201580065670.4
• 申請日: 2015-12-03
• 公開（公告）號: CN107002044B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: J.庫爾
• 申請（專利權）人: 英特維特國際股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N7/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 任曉華;萬雪松

1.穩定轉染的永生化雞胚成纖維細胞(CEF)，其特征在于所述永生化CEF表達SV40 T抗原、表達在異源啟動子控制下的雞端粒酶(cTERT)且不包含外源性逆轉錄病毒長末端重復DNA。

2.細胞培養物，其包含根據權利要求1的永生化CEF。

3.根據權利要求2的細胞培養物，其特征在于所述細胞培養物是禽類病毒或禽類病毒載體感染的。

4.根據權利要求3的細胞培養物，其特征在于所述禽類病毒或禽類病毒載體選自馬立克氏病病毒(MDV)、MDV相關的火雞皰疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、減蛋綜合征病毒(EDSV)、火雞鼻氣管炎病毒(TRT)、呼腸孤病毒(RV)和包含IBDV VP2-基因、IBV-刺突蛋白基因、禽流感HA基因、ILT gD/gI蛋白基因或NDV F-基因的HVT載體。

5.用于制備根據權利要求1的永生化CEF的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

a) 獲得原代CEF細胞，

b) 用以下轉染所述原代CEF：1) 不含LTR序列的DNA分子，其包含轉座子反向重復且包含在合適啟動子控制下的編碼SV40 T抗原的基因，2) 不含LTR序列的DNA分子，其包含轉座子反向重復且包含在合適啟動子控制下的編碼雞端粒酶cTERT的基因，和3) 包含在合適啟動子控制下的編碼轉座酶的基因的DNA分子，

c) 選擇已經培養至少45個細胞周期的CEF細胞。

6.用于制備根據權利要求1的永生化CEF的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

a) 獲得原代CEF細胞，

b) 用不含LTR序列的單一DNA分子轉染所述原代CEF細胞，所述單一DNA分子包含轉座子反向重復且包含在合適啟動子控制下的編碼SV40 T抗原的基因和在合適啟動子控制下的編碼雞端粒酶的基因兩者且包含在合適啟動子控制下的編碼轉座酶的基因，

c) 選擇已經培養至少45個細胞周期的CEF細胞。

7.用于制備根據權利要求1的永生化CEF的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

a) 獲得原代CEF細胞，

b) 用以下轉染所述原代CEF細胞：1) 不含LTR序列的DNA分子，其包含轉座子反向重復，包含在合適啟動子控制下的編碼SV40 T抗原的基因和在合適啟動子控制下的編碼雞端粒酶的基因兩者，以及2) 包含在合適啟動子控制下的編碼轉座酶的基因的DNA分子，

c) 選擇已經培養至少45個細胞周期的CEF細胞。

8.根據權利要求5-7中任一項的方法，其特征在于在步驟c)中選擇已經培養至少100個細胞周期的細胞。

9.禽類病毒或禽類病毒載體的復制方法，所述方法包括以下步驟：

a) 培養根據權利要求1的永生化CEF，

b) 將永生化CEF與所述禽類病毒或禽類病毒載體接觸，

c) 允許所述禽類病毒或禽類病毒載體復制，和

d) 分離后代病毒。

10.根據權利要求9的方法，其特征在于所述禽類病毒或禽類病毒載體選自由馬立克氏病病毒(MDV)、MDV相關的火雞皰疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、減蛋綜合征病毒(EDSV)、火雞鼻氣管炎病毒(TRT)、呼腸孤病毒(RV)和包含IBDV VP2-基因、IBV-刺突蛋白基因、禽流感HA基因、ILT gD/gI蛋白基因或NDV F-基因的HVT載體組成的禽類病毒組。

11.根據權利要求9的方法，其特征在于所述禽類病毒或禽類病毒載體選自由MDV和MDV載體病毒組成的禽類病毒組。