[發(fā)明專利]用于途徑工程中的寡核苷酸序列

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580064337.1
• 申請日: 2015-11-16
• 公開（公告）號: CN108064291B
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: Z·德拉格維克;C·雷辛格;H·迪茨
• 申請（專利權(quán)）人: 科萊恩國際有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/81;C12N15/70;C12N15/74;C12N15/80;C12N1/19;C12N1/21;C12N1/15
• 代理公司: 北京市金杜律師事務(wù)所 11256
• 代理人: 陳文平;徐志明

本發(fā)明包括可以在各種條件下以高水平啟動基因的轉(zhuǎn)錄的新型人工寡核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含該人工寡核苷酸序列的重組DNA片段、包含該重組DNA片段的表達(dá)質(zhì)粒和用該重組DNA片段轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明包括可以在各種條件下以高水平啟動基因的轉(zhuǎn)錄的新型人工寡核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含該人工寡核苷酸序列的重組DNA片段、包含該重組DNA片段的表達(dá)質(zhì)粒和用該重組DNA片段轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。

背景技術(shù)

數(shù)千年來，酵母(釀酒酵母(S.cerevisiae)和狹義酵母屬(S.sensu stricto)物種)用于生產(chǎn)面包和酒精飲料如清酒、葡萄酒或啤酒。通過這種長期的工業(yè)應(yīng)用，酵母適應(yīng)于多種工藝條件且可以耐受生物反應(yīng)器中的機(jī)械力、抑制性物質(zhì)和發(fā)酵產(chǎn)物。而且它們對于溫度的波動是穩(wěn)定的且可以在低pH值下發(fā)酵糖類，這使得污染風(fēng)險(xiǎn)最小化。除此之外，釀酒酵母是重要的實(shí)驗(yàn)室模型系統(tǒng)且可以容易地進(jìn)行遺傳修飾和是一般公認(rèn)為安全的–GRAS狀態(tài)。廣泛的遺傳工具集可用于釀酒酵母且許多細(xì)胞內(nèi)過程如代謝、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳導(dǎo)和其它途徑經(jīng)充分研究，這有助于成功地對酵母工程化以用于多種多樣的應(yīng)用。

尤其，引入多酶途徑需要對特別是關(guān)鍵酶(其可能是異源的或原來的)的基因表達(dá)水平的精確控制以最大化底物利用和/或產(chǎn)物形成。由此，轉(zhuǎn)錄控制在位于基因上游區(qū)域中的寡核苷酸序列(啟動子)處發(fā)生。因此，啟動子強(qiáng)度和調(diào)控是代謝工程的關(guān)鍵點(diǎn)。

因?yàn)閮?nèi)源啟動子通常不完全滿足轉(zhuǎn)錄控制的必要連續(xù)且因此未使細(xì)胞內(nèi)可實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄水平最大化，酵母工程的關(guān)鍵步驟是選擇適當(dāng)?shù)膯幼印?/p>

不同類型的啟動子是本領(lǐng)域中已知的。

誘導(dǎo)型或脫阻抑啟動子允許高水平的轉(zhuǎn)錄控制，但它們依賴于誘導(dǎo)劑或限定的處理?xiàng)l件。調(diào)控的啟動子限于產(chǎn)生毒性蛋白質(zhì)或建立具有毒性中間體的途徑。此外，現(xiàn)有技術(shù)的大多數(shù)啟動子僅已知為使得能夠控制一個(gè)特定的基因的組的轉(zhuǎn)錄。

因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員迄今已知的啟動子總是涉及嚴(yán)重地限制其用途至僅幾種特定應(yīng)用的某些缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明人因此為他們自己設(shè)定了開發(fā)新型的和改進(jìn)的啟動子的任務(wù)，其能夠?qū)Ω鼜V泛的基因?qū)崿F(xiàn)高的轉(zhuǎn)錄控制和對于工業(yè)應(yīng)用是高度可行的。

本發(fā)明的發(fā)明人驚異地發(fā)現(xiàn)這一任務(wù)可以通過以下寡核苷酸序列達(dá)成：

該寡核苷酸序列特征在于其提高類型為編碼選自酶、結(jié)構(gòu)蛋白、輔酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、抗體、激素和調(diào)控因子的蛋白質(zhì)的信使RNA片段、類型為調(diào)控RNA片段、類型為酶活性RNA片段或類型為轉(zhuǎn)移RNA片段的RNA的轉(zhuǎn)錄速率，所述寡核苷酸序列與SEQ ID NO:1具有至少80％的序列同一性。

本申請中氨基酸、肽、核苷酸和核酸的命名遵循IUPAC的建議。一般地，氨基酸在本文內(nèi)按照單字母代碼命名。

根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“寡核苷酸”理解為包含2-1000核酸，優(yōu)選10-900核酸，更優(yōu)選50-850核酸和最優(yōu)選100-820核酸的單鏈或雙鏈DNA或RNA分子。

術(shù)語“DNA”和“RNA”是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。DNA包含脫氧核糖，而RNA包含核糖(在脫氧核糖中，沒有在2'位連接于戊糖環(huán)的羥基)。腺嘌呤的互補(bǔ)堿基不是如在DNA中時(shí)的胸腺嘧啶，而是尿嘧啶，其是胸腺嘧啶的未甲基化形式。

根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含與SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，優(yōu)選至少82％，更優(yōu)選至少85％，特別優(yōu)選至少90％，甚至更優(yōu)選至少92％，還優(yōu)選至少95％，進(jìn)一步優(yōu)選至少98％和最優(yōu)選至少99％的序列同一性的核酸序列。

在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸序列選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。