[發(fā)明專(zhuān)利]使用成對(duì)向?qū)NA進(jìn)行靶向遺傳修飾的方法和組合物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201580063428.3
• 申請(qǐng)日: 2015-11-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107208078B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 安德魯·J.·墨菲;大衛(wèi)·弗倫杜威;卡曼·維納斯·萊;沃基特克·奧爾巴赫;古斯塔沃·德羅格特;安東尼·加戈利亞地;大衛(wèi)·M.·巴倫蘇埃拉;維拉·佛洛妮娜;林恩·麥克唐納;喬治·D.·揚(yáng)科波洛斯
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/90
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/90;C12N15/85;C12N9/22;C12N15/10;A01K67/027;C12Q1/6888
• 代理公司: 廣州三環(huán)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)的基因組靶基因座進(jìn)行雙等位基因修飾的體外方法，包括：

(I)向?yàn)榉侨祟?lèi)細(xì)胞、非多能的人類(lèi)細(xì)胞，或直接源自分化的成年細(xì)胞的人類(lèi)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的細(xì)胞群引入：

(a)Cas蛋白或編碼所述Cas蛋白的核酸；

(b)第一向?qū)NA或編碼所述第一向?qū)NA的DNA，其中所述第一向?qū)NA與所述基因組靶基因座內(nèi)的第一CRISPR RNA識(shí)別序列雜交；

(c)第二向?qū)NA或編碼所述第二向?qū)NA的DNA，其中所述第二向?qū)NA與所述基因組靶基因座內(nèi)的第二CRISPR RNA識(shí)別序列雜交；以及

(d)靶向載體，其包含側(cè)接5’同源臂和3’同源臂的核酸插入物，其中所述5’同源臂與所述基因組靶基因座內(nèi)的5’靶序列雜交，所述3’同源臂與所述基因組靶基因座內(nèi)的3’靶序列雜交，其中如果所述細(xì)胞群為1細(xì)胞期胚胎群，則所述靶向載體的長(zhǎng)度不超過(guò)5kb；

其中所述基因組包含一對(duì)第一同源染色體和第二同源染色體，這對(duì)染色體包含所述基因組靶基因座；并且

其中所述Cas蛋白切割所述第一CRISPR RNA識(shí)別序列和所述第二CRISPR RNA識(shí)別序列中的至少一者，以在所述第一同源染色體和所述第二同源染色體的每一者中產(chǎn)生至少一處雙鏈斷裂；以及

(II)鑒定具有經(jīng)修飾的基因組靶基因座的細(xì)胞，所述經(jīng)修飾的基因組靶基因座包含雙等位基因修飾，所述雙等位基因修飾包括缺失和/或插入

其中所述鑒定包括定量+-的等位基因修飾測(cè)定和保留測(cè)定，

其中所述等位基因修飾測(cè)定包括:

(a)等位基因獲得測(cè)定，以確定來(lái)自所述細(xì)胞的基因組DNA樣品中所述核酸插入物的區(qū)域的拷貝數(shù)；和/或

(b)等位基因丟失測(cè)定，以確定所述基因組DNA樣品中靶向缺失的所述基因組靶基因座的區(qū)域的拷貝數(shù)，和，

其中所述保留測(cè)定確定基因組DNA樣品中與所述5’同源臂雜交的所述5’靶序列的區(qū)域的拷貝數(shù)和/或確定所述基因組DNA樣品中與所述3’同源臂雜交的所述3’靶序列的區(qū)域的拷貝數(shù)，以及

其中所述等位基因修飾測(cè)定和所述保留測(cè)定的組合區(qū)分將所述核酸插入物正確靶向插入到所述基因組靶基因座中和將所述核酸插入物隨機(jī)插入到所述基因組靶基因座外的基因組位置中的隨機(jī)轉(zhuǎn)基因插入，和/或區(qū)分正確的靶向缺失和延伸超出被靶向缺失的所述基因組靶基因座的區(qū)域的缺失。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述等位基因修飾測(cè)定包括所述等位基因獲得測(cè)定，且其中所述等位基因獲得測(cè)定確定所述基因組DNA樣品中所述核酸插入物的多個(gè)區(qū)域的拷貝數(shù)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述等位基因修飾測(cè)定包括所述等位基因丟失測(cè)定，且其中所述等位基因丟失測(cè)定確定所述基因組DNA樣品中靶向缺失的所述基因組靶基因座的多個(gè)區(qū)域的拷貝數(shù)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述核酸插入物包括選擇盒，且其中：

（1）所述5’靶序列與所述選擇盒鄰近，所述保留測(cè)定確定所述5’靶序列的區(qū)域的拷貝數(shù)；或

（2）所述3’靶序列與所述選擇盒鄰近，所述保留測(cè)定確定所述3’靶序列區(qū)域的拷貝數(shù)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟（II）包括鑒定包含經(jīng)修飾的基因組靶基因座的細(xì)胞，所述基因組靶基因座包含缺失，其中步驟（II）包括所述保留測(cè)定和所述等位基因丟失測(cè)定，且其中所述保留測(cè)定中小于2的拷貝數(shù)表示Cas介導(dǎo)的缺失延伸超出靶向缺失的所述基因組靶基因座的區(qū)域。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述保留測(cè)定確定所述基因組DNA樣品中所述5’靶序列的區(qū)域的拷貝數(shù)和所述3’靶序列的區(qū)域的拷貝數(shù)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述等位基因修飾測(cè)定包括所述等位基因丟失測(cè)定和所述等位基因獲得測(cè)定。