[發明專利]確定循環RNA的分布譜的方法

在審

• 申請號: 201580059730.1
• 申請日: 2015-09-03
• 公開（公告）號: CN107076709A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 鐘文婉;J·艾詩;K·弗拉克
• 申請（專利權）人: 加利福尼亞大學董事會
• 主分類號: G01N30/00
• 分類號: G01N30/00;C12Q1/68;C07H21/02;C12N15/113
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司11262
• 代理人: 李平,鄭霞

相關申請的交叉引用

本申請依據35U.S.C.§119要求于2014年9月3日提交的臨時申請號62/045,503的優先權，其公開內容通過引用并入本文。

政府許可權

本發明是由國家科學基金會(National Science Foundation)授予的授權號CHE-1057113和DGE-0813967的政府支持下進行的。政府在本發明中享有一定的權利。

技術領域

本公開內容提供了基于循環微RNA、病毒RNA和長非編碼RNA(long-non-coding RNA，lncRNA)的相關載體分子來對其進行快速分級的方法。本公開內容還提供了，本公開內容的方法可用于通過鑒定與病癥和特定載體相關的特定微RNA、lncRNA和病毒RNA標志物來在受試者中診斷病癥。

背景技術

已認為循環微RNA是用于疾病診斷的良好生物標志物，因為其可被病變的細胞，例如癌細胞特異性分泌。考慮到微RNA在調節基因表達中的關鍵作用，微RNA的活性分泌可與疾病發展密切相關。

通常，從患者的血清提取總微RNA，并分析表達譜以觀察是否能用模式指示疾病階段。但是，盡管已進行了大量篩選，但是這樣的模式并尚未揭示非常令人信服的miRNA標志物。

發明內容

本公開內容提供了一種用于確定樣品中循環RNA的分布的分級方法，其包括：將從受試者獲得的生物流體樣品分級成至少包含外泌體級分、蛋白質級分和脂蛋白級分的級分，其中每個級分包含RNA載體；以及確定或定量各所述級分中的RNA以產生所述樣品中所述RNA針對所述RNA載體的分布譜。在一個實施方案中，所述分級通過進行非對稱流場流分級(asymmetrical flow field-flow fractionation)(AF4)并收集多份洗脫液來進行。在另一個實施方案中，所述分級通過基于芯片的微流體系統來進行。在前述任一實施方案的另一個實施方案中，所述生物流體樣品是血清樣品。在另一個實施方案中，使用厚度為約0.350mm且頂端到頂端長度(tip-to-tip length)為約275mm的、入口三角形寬度為約20mm且出口寬度為約5mm的梯形分離通來分級血清樣品。在另一個實施方案中，積聚壁的表面積為約3160mm²，分子量截止值為10kDA。在另一個實施方案中，所述多份洗脫液在20至25分鐘的時間內作為1分鐘洗脫液進行收集。在另一個實施方案中，從所述多份洗脫液產生所述生物流體樣品的至少6個級分。在另一個實施方案中，所述6個級分由合并在6個單獨且非重疊的時間段內收集的1分鐘洗脫液獲得。在另一個實施方案中，所述6個級分中的每一個都富集具有特定流體動力學直徑的RNA載體蛋白質。在另一個實施方案中，所述級分富集蛋白質、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和外泌體。在另一個實施方案中，通過深度測序或RT-qPCR來確定或定量所述RNA。在前述任意實施方案的另一個實施方案中，所述RNA包括微RNA或lncRNA，或病毒RNA。在另一個實施方案中，所述微RNA或lncRNA或病毒RNA是與疾病或病癥相關的生物標志物。在另一個實施方案中，所述病癥是癌癥。在另一個實施方案中，所述癌癥是乳腺癌。在前述任意實施方案的一個實施方案中，所述RNA為包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和/或9的序列的微RNA。在另一個實施方案中，所述RNA選自由以下各項組成的組：let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-154*、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-18a、miR-18a*、miR-18b、miR-190、miR-191、miR-191*、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a*、miR-199b、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-200a*、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-202*、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-208、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-28、miR-296、miR-299-3p、miR-299-5p、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-302a、miR-302a*、miR-302b、miR-302b*、miR-302c、miR-302c*、miR-302d、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-31、miR-32、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、miR-330、miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、miR-339、miR-33b、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-361、miR-362、miR-363、miR-363*、miR-365、miR-367、miR-368、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-373*、miR-374、miR-375、miR-376a、miR-376a*、miR-376b、miR-377、miR-378、miR-379、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-384、miR-409-3p、miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、miR-452、miR-452*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、miR-493、miR-493-3p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-497、miR-498、miR-499、miR-500、miR-501、miR-502、miR-503、miR-504、miR-505、miR-506、miR-507、miR-508、miR-509、miR-510、miR-511、miR-512-3p、miR-512-5p、miR-513、miR-514、miR-515-3p、miR-515-5p、miR-516-3p、miR-516-5p、miR-517*、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-518a、miR-518a-2*、miR-518b、miR-518c、miR-518c*、miR-518d、miR-518e、miR-518f、miR-518f*、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-519d、miR-519e、miR-519e*、miR-520a、miR-520a*、miR-520b、miR-520c、miR-520d、miR-520d*、miR-520e、miR-520f、miR-520g、miR-520h、miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*、miR-525、miR-525*、miR-526a、miR-526b、miR-526b*、miR-526c、miR-527、miR-532、miR-542-3p、miR-542-5p、miR-544、miR-545、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-549、miR-550、miR-551a、miR-552、miR-553、miR-554、miR-555、miR-556、miR-557、miR-558、miR-559、miR-560、miR-561、miR-562、miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、miR-581、miR-582、miR-583、miR-584、miR-585、miR-586、miR-587、miR-588、miR-589、miR-590、miR-591、miR-592、miR-593、miR-594、miR-595、miR-596、miR-597、miR-598、miR-599、miR-600、miR-601、miR-602、miR-603、miR-604、miR-605、miR-606、miR-607、miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、miR-626、miR-627、miR-628、miR-629、miR-630、miR-631、miR-632、miR-633、miR-634、miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644、miR-645、miR-646、miR-647、miR-648、miR-649、miR-650、miR-651、miR-652、miR-653、miR-654、miR-655、miR-656、miR-657、miR-658、miR-659、miR-660、miR-661、miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a、miR-99b及其任意組合。在另一個實施方案中，所述基于芯片的微流體系統包括：微流體芯片，所述微流體芯片包括至少3個通道，至少3個儲存器和樣品儲存器，其中所述通道與所述至少3個儲存器和樣品儲存器流體連通；第一珠試劑，所述第一珠試劑包含磁珠和與抗原或外泌體相互作用的抗體；以及第二珠試劑，所述第二珠試劑包含帶陽離子電荷的珠。在另一個實施方案中，所述抗體是抗CD63抗體。在另一個實施方案中，所述方法包括：(i)向樣品儲存器添加血清：(a)向樣品儲存器添加第一珠試劑；向樣品儲存器施加磁場并用磁場將第一珠試劑移動通過至少3個通道中的第一通道至至少3個儲存器中的第一儲存器；在第一儲存器中破裂外泌體；移除第一珠試劑；向第一儲存器添加第二珠試劑；(b)向樣品儲存器添加GuHCl、KCl和洗滌劑以使RNA與蛋白質解離；向樣品儲存器添加第二珠試劑以結合RNA；將第二珠試劑移動通過至少3個通道中的第二通道至所述至少3個儲存器中的第二儲存器；以及(c)向樣品儲存器添加硫氰酸胍、洗滌劑和乙醇以使RNA與脂蛋白解離；向樣品儲存器添加第二珠試劑以結合RNA；將第二珠試劑移動通過至少3個通道中的第三通道至所述至少3個儲存器中的第三儲存器；(ii)從第一、第二和第三儲存器的每一個提取RNA。在另一個實施方案中，所述方法還包括能夠破壞蛋白質-RNA相互作用或脂蛋白復合物的試劑。在另一個實施方案中，所述試劑是表面活性劑、有機溶劑、離液鹽的混合物。