[發明專利]用于生成雙特異性鯊魚可變抗體結構域的方法及其用途

在審

• 申請號: 201580059697.2
• 申請日: 2015-10-21
• 公開（公告）號: CN107074961A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: S.貝克;B.霍克;S.齊隆卡;H.科爾馬;M.恩普廷
• 申請（專利權）人: 默克專利股份公司
• 主分類號: C07K16/30
• 分類號: C07K16/30;C40B50/06;C40B40/08;C07K19/00;A61K39/395;A61P35/00;A61P37/02;A61P31/12
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 翟建偉,黃希貴

1.生成具有以下結構的雙特異性鯊魚可變抗體結構域(vNAR結構域)的方法

FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4，

其中所述方法包括以下步驟：

d. 將至少一個編碼高變區2(HV2)的多核苷酸序列隨機化，

e. 檢測vNAR結構域，其中HV2以相比于參考樣品改變的親和力結合目標抗原，且第二目標抗原被由CDR3和CDR1形成的互補位特異性結合，

f. 選擇(b)的vNAR結構域。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述vNAR結構域是vNAR I型、vNAR II型或vNAR IV型之一。

3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中至少一個編碼所述vNAR的多核苷酸上包含的編碼HV2的區域的多核苷酸的隨機化包括基于密碼子的隨機化、NNB隨機化、NNK隨機化、NNS隨機化或偏倚隨機化。

4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中編碼HV2結構域的多核苷酸序列包含核苷酸序列NNN₁(NNN)₇NNN₉ (SEQ ID NO:1)，其中

- 位置1中的密碼子的50％編碼氨基酸賴氨酸，而剩余50％編碼除半胱氨酸以外的任何氨基酸，且

- 密碼子2-8可以編碼任何氨基酸，且

- 位置9中的密碼子的50％編碼氨基酸蘇氨酸，而剩余50％編碼除半胱氨酸以外的任何氨基酸。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中通過酵母表面展示、噬菌體展示、哺乳動物展示或蛋白陣列之一檢測和/或選擇展示與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vNAR。

6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述NAR還包含可檢測標簽。

7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述可檢測標簽位于所述vNAR的氨基末端和/或羧基末端。

8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中vNAR的檢測和/或選擇通過流式細胞術、FACS、ELISA或微流體進行。

9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其中第一和第二目標抗原是細胞表面抗原，優選癌細胞表面抗原。

10.融合蛋白，其包含根據權利要求1-10中任一項所述的隨機化HV2結構域或包含根據權利要求1-10中任一項所述的隨機化HV2結構域的所述vNAR結構域。

11.根據權利要求10所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含IgG-Fc結構域、VH、VL、VHH抗體結構域或其片段之一。

12.根據權利要求10或權利要求11所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是人源化的。

13.根據權利要求10-12中任一項所述的融合蛋白，其中所述Fc-結構域包含人IgG-Fc結構域或其序列變體。

14.根據權利要求10-13中任一項所述的融合蛋白，其中與所述第一目標抗原和所述第二目標抗原結合的融合蛋白在體內誘導ADCC。

15.通過根據權利要求1-9中任一項所述的方法可獲得的vNAR。

16.載體，其包含編碼根據權利要求15所述的vNAR或根據權利要求10-14中任一項所述的融合蛋白的多核苷酸序列。

17.宿主細胞，其包含權利要求16所述的載體。

18.產生根據權利要求10-15中任一項所述的vNAR或vNAR融合蛋白的方法，其中所述方法包括以下步驟：

- 在足以使所述vNAR或vNAR融合蛋白蛋白表達的條件下，培養至少一種根據權利要求17所述的宿主細胞，和

- 分離和純化所述vNAR蛋白或vNAR融合蛋白。

19.多核苷酸文庫，其包含多個編碼根據權利要求1-9中任一項所述的HV2結構域的多核苷酸。