[發明專利]體外膽汁排泄測定法

在審

• 申請號: 201580058484.8
• 申請日: 2015-09-02
• 公開（公告）號: CN107208050A
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發明（設計）人: E·諾維克;C·曹;A·帕雷克;R·弗里德曼;M·L·亞爾穆什;E·普魯德文斯基
• 申請（專利權）人: 休雷爾公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/04
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所11494
• 代理人: 封新琴

發明背景

經常不期望通過肝臟中的首次通過代謝從動物的循環系統中除去治療性化學實體。如果化學實體被肝細胞攝取并且經由膽小管在膽汁中排泄，則化學實體將永遠不會達到其治療靶標。對于肝細胞而言內源性的轉運蛋白負責將底物移動過肝細胞的竇狀膜，然后進入膽小管。膽小管是肝組織中的結構，其從肝細胞接收排泄的組分，并將膽汁轉運到膽總管以從動物中除去。因此，底物的膽汁排泄是一種復雜的過程，其涉及穿過竇狀膜的移位、經由細胞質的運動、和穿過小管膜的轉運。

母體藥物或其代謝物的肝膽排泄經常在藥物的總體清除中起重要作用的理解已經迫使制藥行業探索更好的體外工具來預測這種清除途徑。出于此原因，化學實體用作藥物的合適性的重要決定因素是其受膽汁排泄的程度及其對其它化學實體的膽汁排泄的影響兩者。

本領域已經教導了化學實體的膽汁清除的兩種一般類型的體外測定法。第一種測定類型是利用兩種平行的肝細胞培養物的雙培養測定形式。(BI,Yi-an等,“Use of cryopreserved human hepatocytes in sandwich culture to measure hepatobiliary transport,”Drug Metab Dispos.,Vol.34,No.9,pp.1658-65(2006)；ANSEDE,John H.等,“An In Vitro Assay to Assess Transporter-Based Cholestatic Hepatotoxicity Using Sandwich-Cultured Rat Hepatocytes,”Drug metabolism and Disposition,Vol.38,pp.276-280(2010).)。在第一培養物中，將肝細胞暴露于正常的培養基并且形成并維持小管。在第二培養物中，將肝細胞暴露于設計用于破壞小管的培養基，如不含鈣和鎂的培養基。然后，將化學實體暴露于每種培養物，并允許與肝細胞相互作用達一定培養期。然后，清洗培養物，并評估每種培養物中與細胞相關的化學實體的量。在第一培養物中，與細胞相關的化學實體在膽汁排泄后可以定位于細胞細胞質中或存在于小管中。在第二培養物中，沒有完整的小管，因此與細胞相關的任何化學實體必須存在于細胞質中。通過從存在于細胞質和小管(第一培養物)中的化學實體的量中扣除存在于細胞質(第二培養物)中的化學實體的量，可以測定在第一細胞培養物的膽汁中排泄的化學實體的量。

雙培養測定形式具有若干缺點。第一項缺點是簡單的現實，即使用這種測定形式創建單一膽汁排泄數據點需要原代肝細胞的兩種培養物。原代肝細胞難以獲得，因此非常昂貴。因此，本領域需要使用較少的原代肝細胞來表征化學實體的膽汁排泄的方法。顯然，一種培養方法將使測定法需要的原代肝細胞數目減少50％，因此是非常期望的。第二項缺點是必然在雙培養測定法中通過測量兩種不是膽汁積累的值，即總細胞積累(細胞質和膽汁)和細胞質積累，然后計算這些值之間的差來計算化學實體的膽汁積累。利用這種雙培養方法做出的測量將比膽汁積累的單一直接測量具有更多的固有變異性。膽汁積累的直接測量在雙培養測定形式中是不可能的。

本領域還已經教導了化學實體的膽汁清除的單一培養物體外測定法。(美國專利號7,604,934)。然而，先前教導的測定法是間接的。具體地，它依賴于將單一培養物暴露于標志物化合物(如放射性標記的化合物)，并且在存在和缺乏測試化學實體的情況下比較放射性標志物的膽汁積累。此類測定法假設在存在測試化學實體的情況下標記物的膽汁積累的下降指示測試化學實體通過與由標志物化合物使用的途徑類似的途徑排泄。此測定形式具有幾項缺點，包括低精確性。

出于所有上述原因和其它原因，本領域中需要評估化學實體(如候選治療劑)的膽汁排泄的新的且有效的方法。本發明提供了滿足這些和其它需要的新的且非顯而易見的方法。

發明概述

本發明提供了表征化學實體的膽汁排泄的新的且改善的體外方法。在第一方面，方法包括：a)提供包含形成至少一個膽小管的肝細胞的細胞培養物；b)使所述細胞培養物與第一化學實體接觸足以允許由所述培養物中的肝細胞攝取所述化學實體的時間；c)在不裂解所述肝細胞的情況下破壞所述至少一個膽小管，并且檢測由所述至少一個膽小管釋放的所述第一化學實體和/或其代謝物的量(如果有的話)；并且d)裂解所述肝細胞，并檢測由所述肝細胞釋放的所述第一化學實體和/或其代謝物的量。在一些實施方案中，在步驟a)和b)之間、步驟b)和c)之間、和/或步驟c)和d)之間包括至少一個清洗步驟。