[發(fā)明專利]在分泌弗林蛋白酶的哺乳動物表達系統(tǒng)中產生被完全加工且功能性的因子X

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580055246.1
• 申請日: 2015-08-12
• 公開（公告）號: CN107002041B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設計）人: E.勃姆;F.霍林;J.科恩;M.多卡爾
• 申請（專利權）人: 百特股份有限公司;百特有限責任公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N9/64;A61K38/48;A61P7/04
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 曹立莉

本發(fā)明公開了在表達系統(tǒng)中產生完全加工的成熟因子X的方法，其以50U/mL培養(yǎng)物上清液至300U/mL培養(yǎng)物上清液產生受控量的弗林蛋白酶。還公開了用于表達弗林蛋白酶和因子X的轉化細胞、表達系統(tǒng)和表達載體。

技術領域

本發(fā)明公開的是，在弗林蛋白酶的存在下，用于表達被完全加工的且有活性的重組因子X的表達系統(tǒng)、轉化細胞及其相關方法。

背景介紹

人凝血因子X(FX)、活化的FX(FXa)及其變體被用作血液凝固病癥(包括，但不限于，血友病和血管性血友病)的治療劑。FX是一種維生素K-依賴性絲氨酸蛋白酶，其在內質網中作為單鏈前體蛋白而被合成，隨后在高爾基體中進行細胞內蛋白水解的弗林蛋白酶裂解，然后通過向血流中產生細胞或者在重組表達的情況下向培養(yǎng)基中產生細胞。FX中的三個弗林蛋白酶裂解位點負責恰當?shù)腇X蛋白酶解加工。FX的成熟形式是二硫鍵連接的雙鏈分子，其由重鏈和輕鏈組成，在前體蛋白裂解后形成。該分子的進一步修飾包括輕鏈的γ-羧基化和連接到重鏈的活化肽的N-和O-連接的糖基化。

除了FX外，具有共有識別位點Arg-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO:4)的其他維生素K依賴性凝血因子是普遍表達的內切蛋白酶弗林蛋白酶的底物，也被稱為成對堿性氨基酸殘基切割酶(PACE)。由于高產量表達下細胞內加工的限制，細胞培養(yǎng)物表達系統(tǒng)中對凝血級聯(lián)重組蛋白的適當?shù)牡鞍酌附饧庸な軗p。類似于血管性血友病因子和凝血因子IX(FIX)，其在重組哺乳動物細胞中呈現(xiàn)出高表達率下不足的蛋白酶解加工，低產量CHO細胞克隆中的FX分泌的特征在于被完全加工的FX，而除了被正確加工的FX重鏈和輕鏈種類外，高產量的克隆包含未加工的單鏈FX以及多種未加工形式的FX輕鏈。未加工的FX輕鏈的種類和程度在各細胞克隆之間以及在不同細胞培養(yǎng)條件(如細胞密度)下各不相同。需要額外的體內弗林蛋白酶共表達或后細胞(post-cell)體外培養(yǎng)弗林蛋白酶培養(yǎng)來支持內源性弗林蛋白酶蛋白水解機制，從而促進完整的蛋白質裂解。

弗林蛋白酶的共表達對于高產率下被完全加工的FX表達來說是必不可少的。然而，到目前為止，尚未報道弗林蛋白酶的閾水平可確保在細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)中被完整加工的FX的高百分比。高濃度的弗林蛋白酶是有毒的，因此由產生FX的哺乳動物表達系統(tǒng)的弗林蛋白酶表達水平必須在有毒、但可能加工100％的FX前體蛋白，和那些極低、因而導致在健康的細胞培養(yǎng)物中生產次優(yōu)加工的FX的水平之間保持平衡。

發(fā)明內容

本發(fā)明公開了用于在相同細胞系中表達弗林蛋白酶和人因子X(FX)的系統(tǒng)，從而在培養(yǎng)物上清液中提供關鍵的弗林蛋白濃度，以產生被完全加工且具有完全活性的FX，同時保持該培養(yǎng)物的活力。

因此，本發(fā)明公開了轉化細胞，其包含編碼人弗林蛋白酶的核苷酸序列，使得該轉化細胞向培養(yǎng)物上清液中表達并分泌功能性弗林蛋白酶，其中該功能性弗林蛋白酶在培養(yǎng)約36小時至約78小時后以在培養(yǎng)物上清液中以約50U/mL至約300U/mL的濃度分泌。在一個實施方案中，該轉化細胞還包含核苷酸序列，其編碼可被弗林蛋白酶裂解并呈現(xiàn)出Arg-(Lys/Arg)-Arg基序的蛋白質。在另一個實施方案中，編碼人弗林蛋白酶的核苷酸序列和編碼該蛋白質的核苷酸序列位于不同的表達載體上。在另一個實施方案中，編碼人弗林蛋白酶的核苷酸序列和編碼該蛋白質的核苷酸序列位于相同的表達載體上。

還提供了包含適于表達哺乳動物蛋白質的細胞系的真核蛋白表達系統(tǒng)；適于通過細胞系表達人弗林蛋白酶的第一表達載體，其中所述第一表達載體包含編碼人弗林蛋白酶多肽的核苷酸序列；和適于通過細胞系表達蛋白質的第二表達載體，其中所述第二表達載體包含編碼可被弗林蛋白酶裂解并呈現(xiàn)出Arg-(Lys/Arg)-Arg基序的蛋白質的核苷酸序列，其中所述細胞系能夠在培養(yǎng)約36至約78小時后以約50U/mL至約300U/mL的濃度將功能性弗林蛋白酶分泌到培養(yǎng)物上清液中。