[發明專利]抵抗乳糖殺傷的突變體微生物

有效

• 申請號: 201580053480.0
• 申請日: 2015-11-12
• 公開（公告）號: CN107075506B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 約里·博普雷;索菲耶·德梅埃塞納爾;埃里克·蒂默曼斯
• 申請（專利權）人: 因比奧斯公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/81;C12N15/70;C12N15/10;C12P19/12;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 鄭斌;盧蓓

本發明涉及產生抵抗乳糖殺傷現象的突變微生物的方法以及涉及能夠通過所述方法獲得的微生物。這樣的工程化微生物可用于生產特殊產品，例如但不限于特殊的碳水化合物、糖脂和半乳糖基化化合物。

技術領域

本發明涉及產生抵抗乳糖殺傷現象的突變微生物的方法以及涉及能夠通過所述方法獲得的微生物。這樣的工程化微生物可用于生產特殊產品(specialty product)，例如但不限于特殊糖類、糖脂和半乳糖基化化合物。

背景技術

乳糖殺傷(lactose killing)是公知且深入研究的原理，其在乳糖與另一種碳源的存在下阻礙許多生物體的生長。然而，該現象背后的確切機制是未知的，盡管誘導該現象所需的特征相當清楚。當將乳糖添加到在另一種碳源(例如但不限于甘油或蔗糖)上生長的微生物培養物中時，發生乳糖殺傷。當乳糖轉運基因為可誘導的或組成型表達(33，39，75)時，也發生乳糖殺傷。最初對于在恒化器條件下用IPTG和乳糖調節乳糖通透酶之表達的大腸桿菌(E.coli)觀察到乳糖殺傷(28)。后來對于苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)和運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)也觀察到乳糖殺傷(55，70，77)。這種現象的潛在原因之一歸因于細胞的乳糖轉運蛋白活性的所謂“成本”，這種“成本”導致生長減少或抑制，并且還與細胞外乳糖濃度有關(34)，其在工業過程中大多保持高水平以獲得足夠高的產物滴度和收率。然而，現有技術表明，只要在這些條件下存在乳糖轉運，就應該會發生乳糖殺傷。為了解決乳糖殺傷的問題，已經提出了缺失乳糖通透酶或嚴重損害乳糖攝取(34)。例如，Lodi等(55)缺失(敲除)了乳酸克魯維酵母中的乳糖通透酶，發現乳糖殺傷不再發生。他們的實驗過程中的自發突變進一步表明所選擇的乳糖殺傷陰性菌株在其乳糖攝取方面嚴重受損。然而，為了有效地合成特殊產品或生物產品，乳糖攝取是必需的。因此，缺失乳糖通透酶或嚴重損害乳糖通透酶活性明顯不是解決方案，因為產生這樣的生物產品需要1)有效的乳糖攝取和2)不導致“乳糖殺傷表型”的表達盒。先前已使用用于生產基于乳糖的生物產品的乳糖通透酶，但沒有解決“乳糖殺傷表型”。在過去，這個問題通過嚴重減少乳糖攝取(因此產生很少甚至不產生基于乳糖的特殊產品)或者通過將生長階段與生產階段分開以優先獲得足夠的生物量來解決。在該生長階段之后，在第二階段中添加乳糖以產生特殊產品。在該第二階段中，不發生或強烈減少生長(59)。

因此，目前的共識是，為了避免乳糖殺傷，必須消除或嚴重損害乳糖攝取，因為正常的乳糖攝取將總是導致乳糖殺傷。相比之下，本發明公開了一種篩選方法以找到允許有效攝取乳糖而不經歷乳糖殺傷的乳糖通透酶表達盒！

乳糖是許多生物產品，更特別是特殊糖類(14)、糖脂和半乳糖基化化合物(例如半乳糖基脂、半乳糖神經酰胺和半乳糖基化糖苷配基)的結構單元。在許多情況下，半乳糖部分用于藥物的器官靶向(28)。然而，由于上述“乳糖殺傷”現象，將乳糖作為基質與其他基質組合使用不像所認為的那樣明顯。通常，需要多階段生產系統、非生長耦合細胞系統(non-growing coupled cell system)以避免乳糖殺傷(32，48)。

許多特殊糖類的基本結構骨架由乳糖或半乳糖單元組成。更具體地，人乳寡糖和引申的母乳寡糖(一大類糖類和寡糖)由半乳糖和乳糖單元構成(15)。這些糖類用糖部分進一步修飾，例如N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸(例如N-乙酰神經氨酸、N-羥乙酰神經氨酸、2-酮-3-脫氧-D-甘油半乳糖壬酮糖酸……)(21)，L-巖藻糖等。然后這些化合物的合成需要活化的糖類，例如UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、CMP-唾液酸、GDP-巖藻糖……，這些非常昂貴且難以合成分子并且由于其生物合成所需的能量而最好由活的生長細胞產生。

人/母乳的寡糖組分具有抗炎和益生元效果和/或在治療學中用作營養品、抗炎劑、益生元(prebiotic)或藥物(15，24，68)。然而，仍然需要有效生產后面的高價值化合物的方法。