[發(fā)明專(zhuān)利]抵抗乳糖殺傷的突變體微生物有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201580053480.0 | 申請(qǐng)日： | 2015-11-12 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN107075506B | 公開(kāi)（公告）日： | 2022-06-03 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 約里·博普雷;索菲耶·德梅埃塞納爾;埃里克·蒂默曼斯 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 因比奧斯公司 |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12N15/09 | 分類(lèi)號(hào)： | C12N15/09;C12N15/81;C12N15/70;C12N15/10;C12P19/12;C12R1/865 |
| 代理公司： | 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227 | 代理人： | 鄭斌;盧蓓 |
| 地址： | 比利時(shí)茲*** | 國(guó)省代碼： | 暫無(wú)信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 抵抗 乳糖 殺傷 突變體 微生物 | ||
1.產(chǎn)生微生物的方法，所述微生物當(dāng)在乳糖與其他碳源組合的環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象，其中所述方法包括：
a.通過(guò)突變改變微生物內(nèi)乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，其包括在內(nèi)源或外源乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因前引入異源啟動(dòng)子；對(duì)編碼序列前的含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)或Kozak序列的非翻譯區(qū)進(jìn)行突變；和/或?qū)λ鰞?nèi)源乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的密碼子使用進(jìn)行修飾，其中所述突變導(dǎo)致所述乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，
b.使所述突變微生物在包含非乳糖的碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，
c.在所述突變微生物的生長(zhǎng)期間向所述培養(yǎng)基中添加乳糖，和
d.選擇這樣的微生物，其在所述包含乳糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象，并且保留用所述乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的野生型表達(dá)盒獲得的乳糖通量的至少50％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述在內(nèi)源或外源乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因前引入異源啟動(dòng)子如下進(jìn)行：a)從基因組中缺失內(nèi)源乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并將具有異源啟動(dòng)子的內(nèi)源乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白重新引入在所述微生物基因組內(nèi)的另一位置處；或者b)敲除內(nèi)源乳糖啟動(dòng)子并在所述微生物基因組中的相同位置處引入異源性啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2所述的方法，其中通過(guò)與報(bào)道基因翻譯偶聯(lián)和/或通過(guò)適配體偶聯(lián)來(lái)檢測(cè)所述經(jīng)表達(dá)的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至2所述的方法，其中通過(guò)如由SEQ ID NO:2、3、4和/或5給出的遺傳構(gòu)建體檢測(cè)所述經(jīng)表達(dá)的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至2所述的方法，其中所述乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是乳糖通透酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至2所述的方法，其中所述微生物是細(xì)菌、或酵母。
7.導(dǎo)致乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的并且不導(dǎo)致乳糖殺傷表型的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒包含由SEQ ID NO:1、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57所示的序列。
8.當(dāng)在乳糖與其他碳源組合的環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象并且能夠通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的方法獲得的微生物，所述微生物包含乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)盒，其中編碼序列前的含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)或Kozak序列的非翻譯區(qū)是被突變的和/或其中所述內(nèi)源乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的密碼子使用是被修飾的。
9.當(dāng)在乳糖與其他碳源組合的環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)抵抗乳糖殺傷現(xiàn)象并且能夠通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的方法獲得的微生物，其中所述微生物是細(xì)菌并且包含由SEQ ID NO:1、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57所示之序列的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)盒，或者其中所述微生物是酵母并且包含由SEQ ID NO:7或8所示之序列的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)盒。
10.根據(jù)權(quán)利要求8至9所述的微生物，其中使得編碼來(lái)自乳糖和/或半乳糖降解途徑的酶的基因功能降低或無(wú)功能。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的微生物或根據(jù)權(quán)利要求7所述的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)盒用于生產(chǎn)基于乳糖和/或基于半乳糖的特殊產(chǎn)品的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述基于乳糖的特殊產(chǎn)品是特殊的碳水化合物、糖脂和半乳糖基化化合物。
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