[發(fā)明專利]產(chǎn)生3-羥基丙酸的重組酵母和使用其產(chǎn)生3-羥基丙酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580052598.1
• 申請日: 2015-08-28
• 公開（公告）號: CN107002019B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 樸重珉;樸宰演;樸佑贊;李相珉;徐榮彬;歐佳·梅里亞;科維史度恩·歐蒂;康利·安德魯;勒門·梅里亞;羅胡恩·勞拉;朱赫恩·寶拉
• 申請（專利權(quán)）人: SK新技術(shù)株式會社
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N1/16;C12N1/18;C12P7/42;C12R1/865;C12R1/72;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 張晶;王朋飛

本發(fā)明提供了產(chǎn)生3?羥基丙酸(3?HP)的重組酵母以及使用其產(chǎn)生3?HP的方法，更具體地，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生3?HP的重組酵母，該重組酵母包含外源AADH基因、內(nèi)源ACC基因或外源ACC基因、外源MCR基因和外源HPDH基因，并通過[丙酮酸→乙醛→乙酰輔酶A→丙二酰輔酶A→丙二酸半醛→3?HP]生物合成途徑產(chǎn)生3?HP；以及使用該重組酵母制備3?HP的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及產(chǎn)生3-羥基丙酸(3-HP)的重組酵母和使用其產(chǎn)生3-HP的方法，更具體地，涉及產(chǎn)生3-HP的重組酵母，其包含編碼AADH的外源基因、編碼ACC的內(nèi)源基因或外源基因、編碼MCR的外源基因和編碼HPDH的外源基因，并通過[丙酮酸(Pyruvate)→乙醛→乙酰輔酶A→丙二酰輔酶A→丙二酸半醛→3-HP]的生物合成途徑產(chǎn)生3-HP，以及使用該重組酵母產(chǎn)生3-HP的方法。

背景技術(shù)

3-HP(3-羥基丙酸，C3)是乳酸(2-羥基丙酸)的異構(gòu)體，在其兩端具有羧酸基和羥基，因此是能夠轉(zhuǎn)化成各種化學(xué)品(如1,3-丙二醇、丙烯酸、丙烯酰胺、聚合物等)的有用材料。實際上，由于上述原因，2004年3-HP被美國能源部選為能夠由生物質(zhì)生產(chǎn)的有前途的化學(xué)品之一。特別地，作為用于涂料、粘合劑、添加劑、尿布等的高度市場化的材料，丙烯酸是3-HP的主要應(yīng)用形式。3-HP理論上可以通過發(fā)酵從諸如葡萄糖的各種生物質(zhì)中以100％的收率生產(chǎn)，使用微生物的發(fā)酵工藝適合于滿足對生態(tài)環(huán)境友好和可再生材料的需求。

還沒有利用生物質(zhì)商業(yè)生產(chǎn)3-HP的情況，但已經(jīng)對各種方法進行了研究，獲得經(jīng)濟的3-HP產(chǎn)生菌株成為主要障礙。細(xì)菌被公認(rèn)為是產(chǎn)生有機酸的代表性微生物，并廣泛用于工業(yè)如食品工業(yè)等。然而，將使用工業(yè)細(xì)菌(如大腸桿菌)的有機酸生產(chǎn)應(yīng)用于大規(guī)模化學(xué)工業(yè)(如3-HP生產(chǎn))存在缺點。隨著有機酸的產(chǎn)量增加，氫化形式的酸增加，酸性增加(pH降低)，從而大多數(shù)大腸桿菌的活性降低。在生產(chǎn)高濃度的有機酸的情況下，細(xì)菌需要堿如氫氧化鈉(NaOH)和氫氧化銨(NH₄OH)來保持中性pH。這導(dǎo)致依賴于注入的堿的發(fā)酵過程的成本增加，使提取和分離過程難以進行或者使成本顯著增加。

在最近的將有機酸生產(chǎn)應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)的情況中，使用酵母從葡萄糖生產(chǎn)有機酸。與細(xì)菌相比，酵母對有機酸具有高耐受性，因此即使在高酸性(低pH)下酵母的活性也不會被顯著抑制，使得酵母成為更合適的用于生產(chǎn)有機酸的宿主。特別地，酵母已經(jīng)被常規(guī)地、廣泛地用作用于生產(chǎn)烈酒、工業(yè)乙醇等的工業(yè)生物催化劑，酵母可以被大規(guī)模地培養(yǎng)并且可以不被噬菌體污染，使得酵母與細(xì)菌相比在化學(xué)工業(yè)中的適用性更加優(yōu)異。酵母具有產(chǎn)生有機酸的優(yōu)點，但是使用酵母產(chǎn)生有機酸如3-HP存在幾個缺點。首先，與細(xì)菌相比，對酵母進行基因修飾更為困難，為了表達特定的代謝酶，應(yīng)當(dāng)鑒定用于表達代謝途徑以及特定代謝酶的亞細(xì)胞位置，這是由于其細(xì)胞形狀與細(xì)菌不同，被分為細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)體，例如線粒體、過氧化物酶體等。例如，代表性代謝中間體如乙酰輔酶A主要在酵母的線粒體中產(chǎn)生。然而，如果在胞質(zhì)溶膠中產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物，則也需要在胞質(zhì)溶膠中產(chǎn)生乙酰輔酶A的方法。此外，由于在真菌界存在大量不同的酵母，并且所有酵母都不滿足對高生產(chǎn)率、耐有機酸性和大規(guī)模培養(yǎng)的要求，因此應(yīng)當(dāng)有效地選擇適于產(chǎn)生有機酸的宿主。

已知一些酵母有效地從作為己糖的葡萄糖產(chǎn)生乙醇，一些酵母種類也產(chǎn)生有機酸。在進行修飾以使用微生物產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物時，重要的是保持代謝反應(yīng)的氧化和還原的整體平衡，并且由葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的代謝反應(yīng)是得到適當(dāng)維持的反應(yīng)。即使在基因修飾酵母以產(chǎn)生有機酸的情況下，也應(yīng)當(dāng)適當(dāng)?shù)乇３稚鲜銎胶猓⑶以谕ㄟ^修飾酵母來生產(chǎn)乳酸的情況下，平衡地引入另一還原反應(yīng)的乳酸脫氫酶(LDH)用于補充從乙醛生產(chǎn)乙醇的還原反應(yīng)是重要的。