[發明專利]由靶向測序進行數字測量

有效

• 申請號: 201580050570.4
• 申請日: 2015-08-06
• 公開（公告）號: CN107075581B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 喬納森·斯科爾尼克;道格拉斯·阿莫雷塞;斯特凡妮·C·韋爾加;本杰明·施羅德
• 申請（專利權）人: 紐亙技術公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C40B30/04;C40B30/00
• 代理公司: 北京律盟知識產權代理有限責任公司 11287
• 代理人: 沈錦華

1.一種將多個特定核酸分子定量的方法，其包含：

a.將多個探針與多個特定核酸分子雜交，其中各探針與所述多個特定核酸分子中的特定核酸分子內的已知序列的各探針標靶區雜交并且各探針在其5'端具有第一銜接子，其中所述第一銜接子包含已知序列并用于擴增和/或測序；

b.延伸與特定核酸分子雜交的所述多個探針中的每一者，以產生多個延伸產物；

c.將第二銜接子附接到所述多個探針延伸產物的雙鏈端，其中所述第二銜接子包含已知序列并用于擴增和/或測序；

d.將所述多個探針延伸產物測序以產生測序讀段并合并重復測序讀段以產生所述探針延伸產物中的每一者的序列；及

e.測定與所述探針標靶區雜交的各探針的數目，其中所述數目指示包含所述探針標靶區的所述特定核酸分子中的每一者的數量。

2.一種將多個特定核酸分子定量的方法，其包含：

a.將多個探針與多個特定核酸分子雜交，其中每個探針與所述多個特定核酸分子中的特定核酸分子內的已知序列的各探針標靶區雜交，其中各探針在其5'端具有第一銜接子，其中所述第一銜接子包含已知序列并用于擴增和/或測序；

b.延伸與特定核酸分子雜交的所述多個探針中的每一者，以產生多個延伸產物；

c.將第二銜接序列附接到所述多個探針延伸產物的雙鏈端，其中所述第二銜接序列包含已知序列并用于擴增和/或測序；

d.將所述多個探針延伸產物測序以產生測序讀段并合并重復測序讀段以產生所述多個探針延伸產物中的每一者的序列；

e.將所述多個探針延伸產物中的每一者的所述序列與探針數據庫內的預定序列比對，其中所述探針數據庫包含多個預定序列，其中各預定序列對探針具有特異性；及

f.測定各探針延伸產物的所述序列與測序數據庫內的預定序列的比對數目，其中所述比對數目指示與所述探針雜交的所述特定核酸分子中的每一者的數量。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述多個探針延伸產物的所述序列包含正向讀段、索引讀段和反向讀段中的至少一者。

4.根據權利要求3所述的方法，其中所述第一銜接序列包含以下中的至少一者：索引序列引發位點、索引核苷酸序列、n-隨機堿基序列、正向讀段引發位點、反向讀段引發位點，及其任何組合。

5.根據權利要求4所述的方法，其中各探針退火到其相應特定核酸內的其相應探針標靶區序列的特異性被驗證。

6.根據權利要求4所述的方法，其中所述多個探針延伸產物的所述序列映射到基因組或轉錄組的坐標以驗證預期探針退火和延伸。

7.根據權利要求5所述的方法，其中所述多個探針延伸產物的所述序列與探針數據庫的參考拷貝比對以驗證預期探針退火和延伸。

8.根據權利要求4所述的方法，其中所述反向讀段包含所述探針標靶區。

9.根據權利要求4所述的方法，其中所述正向讀段包含所述探針標靶區。

10.根據權利要求6所述的方法，其中正向讀段映射坐標與所述n-隨機堿基序列的組合確定各探針延伸產物的PCR重復。

11.根據權利要求10所述的方法，其中具有相同正向讀段坐標和相同n-隨機堿基序列的序列鑒定為重復，合并并且以單個特定核酸分子形式計數。

12.根據權利要求10所述的方法，其中具有相同正向讀段坐標但不同n-隨機堿基序列的序列各以相異的特定核酸分子形式計數。

13.根據權利要求4所述的方法，其中正向讀段映射坐標與所述n-隨機堿基序列的組合鑒定特定核酸分子。