[發明專利]淀粉酶變體

在審

• 申請號: 201580034095.1
• 申請日: 2015-04-15
• 公開（公告）號: CN106661564A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: S·耶內維因;S·尼德邁爾
• 申請（專利權）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號: C12N9/28
• 分類號: C12N9/28
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所11247
• 代理人: 張莉,黃革生

技術領域

本發明涉及淀粉酶領域，特別是α-淀粉酶，以及包含該淀粉酶的組合物。本發明還描述了用于生產該淀粉酶的手段和方法，以及淀粉酶和含淀粉酶組合物的用途，例如用于清潔含淀粉污漬、紡織品脫漿、淀粉液化和糖化、烘焙和釀造。本發明還公開了用于在發酵、淀粉酶或含淀粉酶制劑的配制和儲存期間增加淀粉酶純度的手段。

背景技術

淀粉是直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物，其中直鏈淀粉由α-1-4連接的葡萄糖組成，支鏈淀粉包含α-1-4連接的葡萄糖和α-1-6連接的葡萄糖。淀粉酶催化直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原和相關多糖中的糖苷鍵的斷裂。具體地，α-淀粉酶催化隨機(1-4)-α-D-葡萄糖苷鍵的水解斷裂。它們屬于CAZY分類的糖基羥化酶家族13。

淀粉酶，特別是α-淀粉酶，已經用于不同的目的，包括清潔含淀粉污漬(特別是在衣服洗滌和餐具洗滌中)、紡織品脫漿、淀粉改性、液化和糖化(特別是，用于紙漿和造紙工業中，用于糖漿生產，和用于飼料工業中)、烘焙和釀造。

對于酶的工業應用，產品批次的同質性是重要的。特別是對于其中使酶和酶組合物與人或動物直接接觸的那些應用，例如，在清潔組合物和食品或飼料生產中，必須采用嚴格的質量控制標準。這種質量控制的一個目的是確定組合物中沒有意外包含有害物質。理想地，酶組合物不應包含相應酶的降解形式，該降解形式例如可影響酶的底物特異性或導致沉淀。另一個目的是，確定在質量控制中分析的酶制劑可以代表待出售的整個批次。此外，必須確立酶組合物中的酶從質量控制采樣到銷售給客戶和/或最終使用的這段時間中是否改變以及如何改變。

現在已經發現，市售淀粉酶的同質性在很大范圍上是不足的。特別地，已意外地發現，作為僅包含一種酶(即通過SDS-PAGE確定的一種淀粉酶)的商業組合物出售的產品(例如或)，通常包含幾種可通過等電聚焦或離子交換色譜法分離的多肽(本文也稱為“親本淀粉酶”和“幽靈(ghost)”/“幽靈(ghosts)”)。

考慮到蛋白質測序是麻煩且昂貴的，通常僅基于編碼待產生的多肽的核酸序列預測多肽(包括酶)的確切氨基酸序列。然而，從上述發現——聲稱的純酶組合物(即僅包含一種多肽的組合物)實際上包含幾種多肽，必然得出結論：所出售的組合物包含了顯著量的具有未知的一級、二級和三級結構的多肽。因此，除非對組合物中的所有淀粉酶種類進行完全的蛋白質測序(通常這是不進行的)，否則目前不可能提供足夠的信息以使淀粉酶制造商或其客戶完成適當的自由實施(FTO)分析。

發明內容

本發明的一個總體目的是，緩解、減少或消除上述問題。特別地，本發明的一個目的是，提供用于改善包含一種或多種淀粉酶、特別是一種或多種α-淀粉酶的組合物(本文也稱為“淀粉酶組合物”)的同質性的手段和方法。此外，本發明的一個目的是，提供具有改善的多肽同質性的組合物。

根據本發明，提供淀粉酶變體，其中，與使用相應的野生型淀粉酶(或更一般地，不包含如本文所述的兩個或更多個取代的相應淀粉酶)制備的組合物相比，所述變體促進具有增加的同質性的淀粉酶組合物的產生。

特別地，根據本發明，淀粉酶變體優選與SEQ ID NO：1具有至少65％的序列同一性，并且與SEQ ID NO：1相比具有兩個或更多個取代的不同，其中所述兩個或更多個取代獨立地選自以下組：

i)根據SEQ ID NO：1的編號中位置：

3,475,314,

6,95,195,

423,

150,226,255,418,

22,106,285,484,

ii)4,476,315,

7,96,196,

424,

151,227,256,419,

23,107,286,485,

其中，組i)的取代選自A,D,E,F,G,H,I,K,L,P,R,S,T,V,W,Y中的任何取代，優選選自A,G,K,R,S,T中的任何取代，且

其中，組ii)的取代選自F,Y,L,I,W,R,E,M中的任何取代。

本發明還提供淀粉酶組合物，其與包含如本文所定義的相應親本淀粉酶的相應淀粉酶組合物相比，具有減少的形成本文定義的幽靈多肽的傾向。

此外，本發明提供淀粉酶組合物，其與包含如本文所定義的相應親本淀粉酶的相應淀粉酶組合物相比，具有減少的形成異天冬氨酸(下文中“isoAsp”或“J”)和/或異谷氨酸的傾向。