[發(fā)明專利]共價閉合的非編碼免疫調節(jié)性DNA構建體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580000576.0
• 申請日: 2015-02-18
• 公開（公告）號: CN105264074A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發(fā)明（設計）人: C·克洛斯;K·卡普;B·維蒂希;M·施羅夫
• 申請（專利權）人: 莫洛根股份公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

說明書

技術領域

本發(fā)明涉及共價閉合的DNA構建體、藥物組合物和疫苗以及它們調節(jié)免疫系統(tǒng)的用途。

背景技術

術語“免疫療法”是指通過誘導、增強或抑制免疫反應治療疾病。免疫療法的策略是抵抗疾病，如癌癥、傳染病、過敏和哮喘。

已知多種能被用于免疫療法的，稱作免疫調節(jié)劑的活性劑。特定的DNA序列屬于那些已知的免疫調節(jié)劑。Krieg等已經(jīng)描述了大多數(shù)已知的免疫調節(jié)性短DNA序列含有未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤基序(CG基序)(Nature1995374：6522546-549)。與原核生物和病毒相比，在真核生物基因組中，未甲基化CG基序的產生基本上是被抑制的。因此，含有這樣的基序的DNA分子已經(jīng)演化為一種天然的“危險信號”并且觸發(fā)免疫系統(tǒng)對抗原核生物和病毒的病原體。可以通過使用這樣的序列通過免疫療法治療或預防感染進行治療和預防。

包含未甲基化CG基序的DNA構建體能夠通過強烈地刺激天然免疫系統(tǒng)的效應細胞引起相當?shù)纳硇鲂毎錉罴毎?、巨噬細胞、天然殺傷細?NK)和NKT細胞。未甲基化的CG基序通過天然免疫模式識別受體Toll樣受體(TLR)9檢測。雖然確切的識別機制尚未完全明了，但在揭示底層通路上已經(jīng)取得顯著進展(A.Krieg，Nat.Rev.DrugDisc.，5：471-484，2006)。

據(jù)推測含有未甲基化CG的DNA構建體結合至受體，在響應細胞中激發(fā)多個信號級聯(lián)。通過特征性表面分子的上調和細胞因子的分泌，誘導具有主導的Th1模式的適應性免疫。這樣的構建體可以與例如抗體、化療或放療、疫苗或細胞因子組合使用。過敏性疾病和哮喘主要是Th2介導的。通過增加Th1/Th2的比值，Th2介導的應答被削弱，從而這些類型的疾病可以被治療或預防。

通過TLR-9通路上調的表面分子包括(依照細胞類型)例如CD40、CD69、CD80、CD86或CD169。增強的細胞因子的分泌同樣是不同的細胞類型的特征；細胞因子包括例如巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-1α、MIP-1β、白細胞介素(IL)-6、IL-8、干擾素(IFN)-α、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IFN-γ、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1或10kDa的IFN-γ-誘導蛋白(IP-10)。

為了預防或治療疾病，接種疫苗已被證明是一種非常有效的方法。為了確保強大并持久的免疫應答，能夠刺激抗原遞呈細胞，例如樹狀細胞，的佐劑通常與抗原一起給藥，并且為了該目的，TLR9激動劑已經(jīng)顯示出是有效的免疫刺激劑。

臨床前和后續(xù)的臨床研究支持TLR-9激動劑作為免疫調節(jié)劑和/或佐劑的用途，并且證明了他們通過增強體液和細胞應答的抗腫瘤效果。

不依賴任何潛在機制的解釋通過未甲基化CG基序影響或調節(jié)免疫應答，開發(fā)了許多通過使用這樣的基序用于調節(jié)免疫系統(tǒng)的方法。WO1998/018810公開了當含有未甲基化的CG基序的免疫刺激序列是單鏈的一部分時更加有效。然而，由于單鏈核酸的快速降解，給予開鏈的單鏈DNA分子是不可行的。因此，發(fā)展出了保護包含未甲基化CG基序的單鏈或雙鏈DNA構建體的不同方法。

為了實現(xiàn)對DNA核酸酶引起的降解的抵抗，核酸多聚體骨架中的磷酸二酯鍵頻繁地修飾成硫代磷酸酯。近幾年的臨床試驗顯示，這些硫代磷酸酯保護的核酸除了一些降低的刺激活性，硫代磷酸酯保護的毒性排除了或嚴重地限制了這些核酸在任何醫(yī)藥組合物或藥物中的應用。

4類已知的具有不同免疫調節(jié)型的激活劑中，除了一個所有的成員包含線性DNA分子。例外公開在EP1196178。該文獻公開了短的脫氧核糖核酸分子，完全由天然DNA組成的包含部分單鏈的啞鈴形的共價閉合序列的包含CG基序的核酸殘基(“dSLIM”)。根據(jù)EP1196178的公開內容，CG基序位于公開的分子的雙鏈莖兩端的單鏈環(huán)中或雙鏈莖中。單鏈發(fā)卡環(huán)保護雙鏈莖遠離細胞內部或外部的DNA核酸酶的降解。文獻US2009/0053250A1公開了這樣的包含CG基序的啞鈴形共價閉合分子與化療藥物的組合。US2007/0049546A1公開了含有CG基序的啞鈴形共價閉合分子共價連接一個或多個取代基。公開出版物“SchmidtM.等，2006，‘CytokineandIg-productionbyCG-containingsequenceswithphosphorodiesterbackboneanddumbbellshape’，Allergy，Vol.61，pp.56-63”表明這樣的包含特定CG基序的啞鈴形共價閉合分子可能在過敏性疾病的治療中有用。