[發(fā)明專利]突變修飾的巨大芽孢桿菌ALA2細(xì)胞色素P450酶及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810840904.3
• 申請(qǐng)日: 2018-07-27
• 公開（公告）號(hào): CN109082417A
• 公開（公告）日: 2018-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李迅;王亮亮;盧敏;王飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

突變修飾的巨大芽孢桿菌ALA2細(xì)胞色素P450酶及其制備方法和應(yīng)用，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。通過對(duì)P450_BM?3單加氧酶基因的定向改造，選擇的3個(gè)突變點(diǎn)R966L/K972L/W1046H使重組蛋白對(duì)輔酶NADH利用效率大為增加，是原酶對(duì)輔酶NADH利用效率的2.4倍，酶活達(dá)到11415 U/mg。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種突變修飾的巨大芽孢桿菌ALA2細(xì)胞色素P450酶及其制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)背景

來源于巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)細(xì)胞色素P450_BM-3(又稱CYP102A1)是一種可溶性的單加氧酶，它能夠在生理?xiàng)l件下，催化長鏈脂肪酸的末端羥基化，不飽和脂肪酸的雙鍵的環(huán)氧化等。(Munro AW,Girvan HM,McLean KJ:Cytochrome P450--redoxpartner fusion enzymes.Biochim Biophys Acta 2007,1770(3):345-359.)研究發(fā)現(xiàn)P450_BM-3單加氧酶主要由兩個(gè)功能域組成：N端的P450功能域以及C端的NADPH-P450還原酶功能域。(Degtyarenko KN:Structural domains of P450-containing monooxygenasesystems.Protein engineering 1995,8(8):737-747.Guengerich FP,Martin MV,SohlCD,Cheng Q:Measurement of cytochrome P450and NADPH-cytochromeP450reductase.Nat Protoc 2009,4(9):1245-1251.)其中P450功能域含有血紅素輔基(heme)，而NADPH-P450還原酶功能域又包括FMN、FAD和NAD結(jié)合域，這些結(jié)合域負(fù)責(zé)將電子從供體NADPH轉(zhuǎn)移至P450功能域的血紅素輔基，最終傳遞給分子氧，活化分子氧。這樣的結(jié)構(gòu)組成和排列保證P450_BM-3單加氧酶只需要脂肪酸底物和還原力NADPH就可以表現(xiàn)出優(yōu)良的催化活性。(Nelson DR:The cytochrome p450homepage.Hum Genomics 2009,4(1):59-65.)盡管NADPH和NADH結(jié)構(gòu)和生理功能極為相似，但是跟NADH相比，NADPH價(jià)格昂貴，穩(wěn)定性較差。(Rosell A,Valencia E,Ochoa WF,Fita I,Pares X,Farres J:Complete reversalof coenzyme specificity by concerted mutation of three consecutive residuesin alcohol dehydrogenase.J Biol Chem 2003,278(42):40573-40580.)。國內(nèi)外也有實(shí)現(xiàn)了各類細(xì)胞色素P450酶的異源表達(dá)及應(yīng)用的研究報(bào)道，但均未進(jìn)行該基因的輔酶特異性改變的突變修飾研究。因此，若能通過定向改造改變其基因序列，從而改變其輔酶特異性，可其該酶的適用性大大拓展，使用成本大大降低。細(xì)胞色素P450_BM-3酶單加氧酶的NADPH-P450還原酶黃素結(jié)合域與NADPH復(fù)合物晶體具有良好的分辨率(PDB ID：4DQL)，可以用于輔酶特異性的分析。利用DeepViewer軟件對(duì)其A亞基的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分析，評(píng)估NADPH分子周圍潛在的極性相互作用和空間位阻，具體評(píng)估結(jié)果見圖1。發(fā)現(xiàn)在NADPH分子中磷酸基團(tuán)范圍內(nèi)存在一個(gè)小的空腔，這個(gè)空腔里面含有一兩個(gè)堿性氨基酸殘基Arg⁹⁶⁶、Lys⁹⁷²和一個(gè)側(cè)鏈羥基氨基酸殘基Ser⁹⁶⁵。推測Arg⁹⁶⁶的側(cè)鏈氨基、Lys⁹⁷²側(cè)鏈的胍基和Ser⁹⁶⁵側(cè)鏈的羥基能夠與NADPH分子中的磷酸基團(tuán)相互作用，形成穩(wěn)定的氫鍵或離子鍵，這些相互作用有利于P450_BM-3單加氧酶對(duì)NADPH分子的識(shí)別，以及協(xié)助NADPH分子在復(fù)合體中的定位，從而使P450_BM-3單加氧酶對(duì)NADPH表現(xiàn)出特異性。于此同時(shí)，在4DQL晶體結(jié)構(gòu)中，我們還發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基Trp¹⁰⁴⁶與FAD分子的異咯嗪環(huán)相互平行。根據(jù)電子在P450_BM-3單加氧酶中的流動(dòng)情況分析，Trp¹⁰⁴⁶的吲哚基側(cè)鏈體積相對(duì)較大，對(duì)FAD異咯嗪環(huán)的活動(dòng)造成空間位阻，不利于電子從NADPH流向FAD，降低電子的傳遞效率，從而影響酶的催化效率。