[發明專利]一種用于槍烏賊科物種線粒體全基因組擴增的通用引物及擴增方法

在審

• 申請號: 201811105404.1
• 申請日: 2018-09-21
• 公開（公告）號: CN109266645A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 江麗華;龔理;劉炳艦;呂振明;劉立芹
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6806
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種用于槍烏賊科物種線粒體全基因組擴增的通用引物，其特征在于：所述通用引物包括6對引物，所述通用引物包括1對擴增長片段引物和5對擴增普通片段引物。

2.根據權利要求1所述的一種用于槍烏賊科物種線粒體全基因組擴增的通用引物，其特征在于：所述擴增長片段引物為：

LAF：5’-TAATCCTCAGTGAGACCAATGAATCT-3’，

LAR：5’-GGTCCACAGATCATAACGAATATGG-3’。

3.根據權利要求1所述的一種用于槍烏賊科物種線粒體全基因組擴增的通用引物，其特征在于：所述擴增普通片段引物為：

F1：5’-TAGAGCATAGTAGGGTATCTAATCCTAGT-3’，

R1：5’-TGTACAACATCACTGTAACCCGTTCA-3’；

F2：5’-GGTCAACAGATCATACAGTTATTGG-3’，

R2：5’-CATACTTCAGGGTGACCATAGACTCT-3’；

F3：5’-CTCCAGATATAGCTATCACG-3’，

R3：5’-TGCGTCTCCTCCACCTCAT-3’；

F4：5’-TTACTTCTATTCTGAGTCCT-3’，

R4：5’-TCGATATACAATTGCGTCTACG-3’；

F5：5’-GGTCGACACATCATAGAGATATTGG-3’，

R5：5’-TAACTTCAGCGTGACCAAGGCATCC-3’。

4.根據權利要求1所述的一種用于槍烏賊科物種線粒體全基因組擴增的通用引物，其特征在于：所述槍烏賊科物種包括中國槍烏賊、日本槍烏賊、劍尖槍烏賊、福氏槍烏賊、皮氏槍烏賊、萊氏擬烏賊、杜氏槍烏賊、尤氏槍烏賊、神戶槍烏賊、乳光槍烏賊、火槍烏賊。

5.一種權利要求1所述的用于槍烏賊科物種線粒體全基因組擴增的通用引物的設計，其特征在于：從Genbank數據庫中下載目前所有已經公布的槍烏賊科物種線粒體全基因組序列，對這些序列進行多重比對，找出比較保守的區域以及變異較大的區域，并在兩段保守區域設計通用引物。

6.一種基于權利要求1所述的通用引物的槍烏賊科物種線粒體全基因組的擴增方法，其特征在于：以提取的槍烏賊科物種基因組DNA為模板，首先用擴增長片段引物進行LA-PCR擴增，用擴增普通片段引物進行普通PCR擴增，PCR產物經1.0％瓊脂糖電泳檢測后送生物公司測序，然后對測序的結果進行序列拼接、校對，即得線粒體基因組全序列。

7.根據權利要求6所述的用于槍烏賊科物種線粒體全基因組擴增的通用引物的擴增方法，其特征在于：所述LA-PCR擴增采用50ul體系，包括1ul 20uM F引物、1ul 20uM R引物、8ul 2.5mM dNTP、5ul 10×buffer、0.5ul 5U/ul LA-Taq酶、2.5ng DNA模板、滅菌蒸餾水加至50ul。

8.根據權利要求6所述的用于槍烏賊科物種線粒體全基因組擴增的通用引物的擴增方法，其特征在于：所述LA-PCR擴增的反應條件為：93℃預變性5min；92℃變性30s，53℃退火30s，70℃延伸600s，擴增20個循環；然后繼續在93℃變性30s，53℃退火30s，70℃延伸610s，擴增20個循環；70℃總延伸10min。

9.根據權利要求6所述的用于槍烏賊科物種線粒體全基因組擴增的通用引物的擴增方法，其特征在于：所述普通PCR擴增采用50ul體系，包括1ul 20uM F引物、1ul 20uM R引物、4ul 2.5mM dNTP、5ul 10×buffer、3ul 25mM MgCl₂、0.25ul 5U/ul Taq酶、2.5ng DNA模板、滅菌蒸餾水加至50ul。

10.根據權利要求6所述的用于槍烏賊科物種線粒體全基因組擴增的通用引物的擴增方法，其特征在于：所述普通PCR擴增的反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，擴增30個循環；72℃總延伸7min。