[發明專利]一種草魚腫瘤壞死因子α基因的重組表達方法

有效

• 申請號: 201310285117.4
• 申請日: 2013-07-09
• 公開（公告）號: CN103509814A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 周紅;陳丹燕;張安英
• 申請（專利權）人: 電子科技大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/28;C12N1/21
• 代理公司: 成都宏順專利代理事務所(普通合伙) 51227
• 代理人: 周永宏

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及草魚（Ctenopharyngodon?idella）腫瘤壞死因子α（ΤΝF-α)基因的克隆、重組表達、表達產物的分離純化與活性鑒定等技術。

背景技術

腫瘤壞死因子alpha（tumor?necrosis?factor-alpha,TNF-α）是一種重要的細胞因子。早在30多年前，Carswell等人發現了一種存在于血清中，能抑制和殺傷某些腫瘤細胞，并使體內腫瘤發生出血壞死的蛋白物質，被命名為腫瘤壞死因子(tumor?necrosis?factor,TNF)。Shalaby等人把由活化的單核細胞、巨噬細胞和T細胞分泌的腫瘤壞死因子，命名為TNF-α；而把由活化的T淋巴細胞和NK細胞分泌的淋巴毒素，命名為TNF-β。TNF-α前體是Ⅱ型跨膜蛋白，經TNF-α轉換酶(TNF-αconverting?enzyme,TACE)裂解后，形成釋放到胞外的可溶性成熟分子。在生理條件下，TNF-α以非共價三聚體結構與細胞表面的兩種特異性跨膜受體TNFR1和TNFR2結合，啟動下游的信號轉導通路，從而參與和調控機體的免疫功能和炎癥反應，發揮促進細胞生長、分化、凋亡等重要作用。自從牙鲆中克隆出第一個TNF-α基因的全長cDNA序列開始,腫瘤壞死因子α在魚類中的研究開始受到重視。目前在多種魚中已有腫瘤壞死因子α基因克隆，其中包括：河豚（Savan2005）、虹鱒（Laing2001）、金頭鯛（Garcia-Castillo2002）、鱖魚（Xiao2007）、斑馬魚（Savan）、鯉魚（Saeij2003）、金魚（Grayfer2008）等。重組金魚腫瘤壞死因子能誘導巨噬細胞的趨化反應、吞噬作用、呼吸爆發反應（Grayfer2008）。重組虹鱒腫瘤壞死因子α能增強白細胞的遷移和吞噬作用，并能上調IL-1β、IL-8、TNF-αCOX-2等基因的表達（Zou2003）。但是，重組烏頰魚TNF-α和大菱鲆TNF-α不能激活吞噬細胞的呼吸爆發（Roca2008，Orda′s2007），而且重組烏頰魚TNF-α只能輕微上調IL-1β和TNF-α的表達（Roca2008）。這些魚類TNF-α表現出的功能差異說明其功能具有種屬特異性，因此有必要獲得重組草魚TNF-α用于其在草魚中的功能檢測和應用。

草魚（Ctenopharyngodon?idellus）屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，俗稱有：鯇、油鯇、草鯇、白鯇、草魚、草根（東北）、混子、黑青魚等。英文名：Grass?carp。因其生長迅速，飼料來源廣，是中國淡水養殖的四大家魚之一，具有重要的經濟價值。但草魚抗病力和成活率較低，易患出血病、爛鰓病、赤皮病和腸炎病等。加之高密度養殖增加了水產動物之間病原體交叉感染的機會，使病害日益加劇，因此研究草魚免疫系統的各類免疫反應及其調節機制十分重要。由于腫瘤壞死因子α在魚類炎癥反應中具有廣泛生物學活性及其在免疫調控中的重要性，因此檢測腫瘤壞死因子α在草魚中的功能對草魚免疫系統的研究以及魚類疾病的治療密切相關。同時，由于魚類腫瘤壞死因子α與哺乳動物和兩棲動物的腫瘤壞死因子α分子在結構和功能方面存在較大差距，不能用其他種族的腫瘤壞死因子α蛋白蛋白和抗體代替魚類腫瘤壞死因子α進行研究，加之魚類腫瘤壞死因子α抗體的缺乏使對腫瘤壞死因子α功能地位的研究陷入瓶頸。

本發明的有益效果：通過本發明的技術方案可以工業化生產重組草魚腫瘤壞死因子α蛋白。重組草魚腫瘤壞死因子α不僅可用于制備相應魚類腫瘤壞死因子α抗體和其它魚類免疫機制的理論研究，也可用于制作飼料添加劑、疫苗免疫增強劑以及病害防治藥物以及其它醫藥產品等應用研究；同時，草魚腫瘤壞死因子α能誘導草魚其它細胞因子的表達，如白細胞介素1β和腫瘤壞死因子α自身，從而增強草魚趨化能力，提高草魚免疫保護能力。

發明內容

腫瘤壞死因子α在機體免疫調節等方面起著非常重要的作用，但是由于機體自身分泌腫瘤壞死因子α存在產量低、半衰期短等不足，本發明針對這些問題根據草魚腫瘤壞死因子α基因，采用克隆重組技術，構建草魚腫瘤壞死因子α體外重組質粒，通過大腸桿菌表達載體，經誘導在體外大量表達重組草魚腫瘤壞死因子α蛋白，并對其進行分離純化和鑒定，提供草魚腫瘤壞死因子α蛋白的重組表達方法，為草魚腫瘤壞死因子α蛋白的產業化應用提供可能性。同時，本發明也為制備相應魚類腫瘤壞死因子α抗體和相關魚類免疫機制的理論研究奠定了基礎。

為了實現上述目的，本發明的技術方案具體如下：