[發(fā)明專(zhuān)利]一種分離戊糖片球菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110281617.1
• 申請(qǐng)日: 2011-09-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102329750A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王升平;印遇龍;李麗立;姚康;黃瑞林;李鐵軍;李鳳娜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12N1/02;C12R1/01
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明涉及一種分離戊糖片球菌的方法，尤其是一種適應(yīng)于從動(dòng)物胃腸道中分離戊糖片球菌的方法。

背景技術(shù)

????片球菌屬拉丁學(xué)名為Pediococcus?Claussen，細(xì)胞呈球形且永不延長(zhǎng)，直徑為1.2-2.0微米；在適宜條件下，分裂以直二個(gè)方向形成四聯(lián)，單個(gè)細(xì)胞罕見(jiàn)，不形成鏈狀；革蘭氏染色陽(yáng)性；不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢；兼性厭氧，有的菌株在有氧時(shí)會(huì)抑制生長(zhǎng)；最適生長(zhǎng)溫度為25-40℃。

戊糖片球菌（Pediococcus?pentosaceus）是片球菌中的一種，菌落圓形、乳白色、光滑、凸起、邊緣整齊、不透明、革蘭氏染色陽(yáng)性。中國(guó)農(nóng)業(yè)部已經(jīng)批準(zhǔn)戊糖片球菌可以作為飼料添加劑中的微生物菌種用于飼料和養(yǎng)殖業(yè)中。一般用于分離戊糖片球菌的方法為倒平板法，將固體培養(yǎng)基滅菌后倒入平皿中，冷卻后將含有戊糖片球菌的樣品稀釋液涂抹在培養(yǎng)基表面上，然后置于常規(guī)生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于戊糖片球菌屬于兼性厭氧菌，氧氣太多的情況下會(huì)抑制戊糖片球菌的生長(zhǎng)，因此，該方法可能降低戊糖片球菌的分離機(jī)率，此外，該方法分離過(guò)程中，其它非戊糖片球菌一樣也可以在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，從而增加了后續(xù)鑒定工作的工作量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供了一種分離戊糖片球菌的方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，將所要分離的樣品稀釋液和3毫升培養(yǎng)基混合后，倒入平皿中，待凝固后，再倒入25毫升培養(yǎng)基，人為形成一個(gè)厭氧環(huán)境，分離出的細(xì)菌克隆中為戊糖片球菌的幾率為100%，該方法更準(zhǔn)確，并顯著減少工作量。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種分離戊糖片球菌的方法，其步驟是：

A、將配制的MRS固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH6.0-6.6后，置于滅菌鍋115?℃滅菌13-18分鐘，自然冷卻到40-45?℃。

、將待分離的樣品用無(wú)菌雙蒸水以體積比1:10混合，渦旋一分鐘后靜置4-6分鐘。

、????????????移取上清1毫升進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)缓蠓謩e取10^-3、10^-4、10^-5三個(gè)稀釋度各100微升樣品，分別和3毫升上述制備的液態(tài)MRS固體培養(yǎng)基混合后，加入不同的玻璃平皿（直徑80毫米）中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和樣品混合物均勻分布在培養(yǎng)皿底部；

D、????????????待混合物其凝固后，再加入25毫升左右液態(tài)MRS固體培養(yǎng)基，凝固后置于生化培養(yǎng)箱中29-31℃恒溫培養(yǎng)46-50小時(shí)。最后，戊糖片球菌將在培養(yǎng)皿底部被分離出來(lái)。

為從樣品中更準(zhǔn)確的篩選出戊糖片球菌（Pediococcus?pentosaceus），發(fā)明了一種分離戊糖片球菌的方法，運(yùn)用該方法成功分離得到了戊糖片球菌。

所述MRS固體培養(yǎng)基為：

組成成份????????重量份

牛肉蛋白粉?????8-12

魚(yú)肉汁?????????8-12

酵母浸出汁粉???3-7

葡萄糖?18-22

醋酸鈉?3-7

檸檬酸二銨???????1-3

吐溫80????????0.08-?0.2

硫酸鎂?0.48-?0.68

硫酸錳?0.18-?0.38

瓊脂粉?13-17

蒸溜水?800-1200。

該方法無(wú)需厭氧培養(yǎng)相關(guān)器皿，也不需要二氧化碳培養(yǎng)箱。通過(guò)將培養(yǎng)基置于樣品之上，構(gòu)建一個(gè)適合戊糖片球菌生長(zhǎng)的兼性厭氧環(huán)境，為戊糖片球菌的分離找到一種簡(jiǎn)單、方便的方法。分離出的細(xì)菌克隆中為戊糖片球菌的幾率為100%，該方法更準(zhǔn)確，并顯著減少了工作量。

附圖說(shuō)明

圖1為一種分離戊糖片球菌的方法流程示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述：

一種分離戊糖片球菌的方法，其步驟是：