[發明專利]一種人類金屬硫蛋白-4融合蛋白表達載體

有效

• 申請號: 201510976807.3
• 申請日: 2015-12-22
• 公開（公告）號: CN105441472B
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 李萬波;陜婧婧;盧嬋
• 申請（專利權）人: 盤古基因生物工程(南京)股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發明公開了一種人類金屬硫蛋白?4融合蛋白表達載體。所述表達載體克隆區的上游包含人類脂肪酸結合蛋白(hFABP6)，下游為金屬硫蛋白MT4。本發明還揭示了應用所述表達載體的方法，包括表達菌株的構建、擴增、誘導表達、融合蛋白純化的基本方法。本發明所揭示的hFABP6?MT4融合蛋白表達載體具有如下特點：①高效表達MT4蛋白；②可溶性表達。

技術領域

本發明屬于基因工程和發酵工程領域，涉及一種人類金屬硫蛋白-4融合蛋白表達載體，尤其是涉及一種具有伴侶樣蛋白功能的人類游離脂肪酸結合蛋白與人類金屬硫蛋白的融合表達。

背景技術

1957年Margoshes和Vallee在研究金屬生物學作用時，從動物器官分離出一種新的蛋白質，它含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子，此物質稱為金屬硫蛋白(英文為Metallothionein，簡稱MT)。

關于金屬硫蛋白,全球從1978年到1999年，先后在瑞士、日本、美國共舉行了四次國際專題研討會，第五次國際專題研討會于2005年10月在北京召開。1987年我國將MT列入[863]計劃，“八五”、“九五”重大攻關項目，1994年列入國家級[火炬計劃]；2003年MT項目被國家科技部列為“國家科技成果重點推廣計劃項目,1995年聯合國將MT列入向世界各國推薦的生物技術產品。由此可見從國內到國外對MT的研究、開發、推廣、應用的高度重視。

金屬硫蛋白(Metallothionein，MT),又稱巰基金屬結合蛋白。一類非酶蛋白質，除含有鎘(Cd)、鋅(Zn)的MT外，在自然界也存在含有銅(Cu)、汞(Hz)、金(Au)、鉍(Bi)等元素的MT。MT的蛋白分子內不含有芳香族氨基酸和組氨酸。讓MT中50％的金屬離子發生解離的pH值分別為：Zn-MT:3.5～4.5；Cd-MT:2.5～3.5；Cu-MT<1.0。因MT缺乏芳香族氨基酸，故在280nm處無吸收峰，然而具有與金屬相關的吸收峰。去金屬的MT在190nm處有一個吸收峰。所有脊椎動物、多數植物和微生物體內都含有MT。無論是自然產生還是誘導產生的MT，其氨基酸組成基本相同、主要不同在所含金屬及其含量。

人類MT按分子特征和分布分為四個亞群：MT1、MT2、MT3、MT4。MT1又分9個亞類，MT2又分MT2a和MT2b。MT1和MT2分布全身，MT3分布于腦，MT4主要分布于皮膚。

自由基是人體衰老的第一大元兇，自由基還與人類若干中老年疾病緊密相關，導致人體免疫力逐步下降，MT是目前已知的最好的自由基清除劑，減少自由基就能延緩人體衰老步伐。同時，MT也是目前唯一有效的重金屬解毒和清除蛋白。人體重金屬超標或中毒，損害肝、腎、骨、腦和記憶功能，引發多種疾病。

大量的科學實驗和臨床結果表明：MT在抗電離輻射、紫外線照射、解除金屬毒素、治療或緩解消化道潰瘍、心肌梗塞、各種炎癥、各種癌癥、保護皮膚、減輕吸煙及環境污染對人體的危害及抗過敏等方面均有顯著療效。

目前MT產品主要從兔肝、馬腎、豬肝和微生物(如粗脈孢菌)等中提取，成本高、產量低，抑制了她的廣泛使用，比如食品、飲品、化妝品等。

發明內容

本發明的目的是提供一種人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

一種人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體是將人類金屬硫蛋白-4(MT4)的編碼序列作為目標蛋白編碼序列插入伴侶樣蛋白的融合蛋白表達載體的多克隆區所得；所述的伴侶樣蛋白的融合蛋白表達載體上游含有人類游離脂肪酸結合蛋白-6的編碼序列，人類游離脂肪酸結合蛋白編碼序列下游包含一段柔性接頭區和用于插入目標蛋白編碼序列的多克隆區。

所述的人類游離脂肪酸結合蛋白與人類天然游離脂肪酸結合蛋白的同源性等于或大于85％，所述的人類游離脂肪酸結合蛋白-6的編碼序列優選為經過密碼子優化的編碼序列。