[發明專利]一種薄荷多倍性的鑒定方法

在審

• 申請號: 201510948998.2
• 申請日: 2015-12-18
• 公開（公告）號: CN105602886A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 于盱;梁呈元;亓希武;房海靈;李維林
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明具體涉及一種薄荷（MenthahaplocalyxBriq.）多倍性的鑒定方法。

背景技術

薄荷（MenthahaplocalyxBriq.）為唇形科薄荷屬多年生草本植物，全草入藥，用于治療風熱感冒、風溫初起、頭痛、目赤、喉痹、咽喉腫痛、口舌生瘡、牙痛、蕁麻疹、風疹等等，其莖、葉中所含的揮發油被廣泛地應用于食品、醫藥、化妝品、香料、煙草等工業。中國是世界公認的薄荷主產國，江蘇省為薄荷的道地產區，但長年栽培的很多品種都出現了嚴重退化，鮮草和薄荷油產量下降的情況。多倍體有很多二倍體所沒有的優勢性狀，如植株的巨大性、抗性增加、有機合成速率加快及克服遠源雜交不育性。發展薄荷的多倍體育種技術有利于薄荷優良品種的選育。然而，薄荷是傳統中藥，栽培歷史悠久，經過多年的人工選育和自然選擇其遺傳背景已經相當復雜，在進行多倍體育種前需要先摸清加倍實驗材料的倍性基礎。

傳統的倍性鑒定方法包括形態鑒定法，多倍體具有生長緩慢，發育遲緩，花期推后等特性。因此，整個生長期均可以外部形態特征來判斷，這是初步鑒定是否為多倍體的最簡單、最直觀的方法。但無法準確鑒定具體倍性。細胞學鑒定法，例如對植株花粉母細胞的染色體數目進行技術觀察，由于薄荷具有唇形科植物特征的輪傘花序，花小進行花粉母細胞的培養非常困難因此也不易使用。流式細胞分析儀測定法是目前最快速且有效的鑒定細胞倍性的方法而。但其原理是根據DNA含量測定，再通過比較DNA含量來推斷細胞的倍性。因此需要首先明確對照植株倍性才能比較出檢測株系倍性。通過檢測分生旺盛的器官、組織的染色體數目來進行鑒定，這是最直接、最準確的一種鑒定法。這種方法切實可行，廣泛應用于倍性鑒定。但這一方法也往往因取材、觀察視野和技術誤差等因素影響結果的準確性。利用該方法進行倍性研究前需要對所取分裂旺盛部位進行預實驗和觀察對分裂時期有所把握才能完成鑒定。作者曾利用不定根尖壓片方法進行過薄荷屬植物染色體觀察研究（薄荷屬植物染色體觀察，江蘇農業科學，2009年第4期，190頁）但經過觀察該方法所得到的具有有絲分裂相細胞少，處于分裂中期可用于染色體觀察的細胞數目更難發現，并且根尖細胞結構致密，分散難度大，解離后敲片時間長技術難度高不易于掌握和大量樣本的分析。

發明內容

本發明針對傳統現有技術的不足之處，提供了一種薄荷多倍性鑒定的方法為了該植物倍性育種提供技術支持。

為了達到上述目的，本發明提供了一種薄荷多倍性鑒定的方法，包括如下步驟：

（1）分生組織準備：

選取當年生植株葉片作為外植體，沖洗干凈后，進行消毒；切取0.5×0.5cm大小，將其接種于愈傷組織誘導培養基中進行愈傷組織的誘導，培養溫度為18-24℃，首先在黑暗中培養24h，然后進行正常培養15-20d；所述正常培養條件為：溫度18-24℃，光照強度為1600-2000lx光照時間為8-10h/d，；所述誘導培養基為MS培養基并添加激素2,4-D和KT；所述誘導培養基中2,4-D濃度為1.0-6.0mg/L，KT濃度為0.5-1.0mg/L；將得到的薄荷葉片切口邊緣愈傷組織切割后接入繼代增殖培養基中進行繼代培養25-35d，培養溫度為20-26℃，光照時間為10-16h/d，光照強度為1600-2000lx；所述繼代增殖培養基為MS培養基并添加激素2,4-D和KT；所述繼代增殖培養基中2,4-D濃度為2.0-4.0mg/L，KT濃度為1.0-2.0mg/L；

（2）分生組織的處理：取步驟（1）中增殖旺盛的愈傷組織，切割后浸泡于含有0.1-0.2%秋水仙素溶液中2-6h后取出，蒸餾水清洗表面溶液后用乙醇-冰醋酸濃度比（3:1）固定液固定24h后取出蒸餾水清洗表面溶液；充分清洗至無味后用2.5%混合酶液酶解室溫下2-4h；蒸餾水洗去酶液后于新鮮蒸餾水中浸泡30min；

（3）分生組織細胞壓片：取步驟（2）中處理后的愈傷組織于載玻片上用鑷子將其壓碎，去除大塊殘碎材料，加入改良的苯酚品紅溶液染色后將載玻片在酒精燈上加熱，染色完成后用45%醋酸溶液分色，加上蓋玻片后用鑷子輕敲蓋片使細胞分散均勻；

上述誘導培養基、繼代增殖培養基中均含有瓊脂6.0-7.0g/L、蔗糖25-35g/L，且pH值為5.6-5.8。