[發(fā)明專利]一種大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510935009.6
• 申請日: 2015-12-15
• 公開（公告）號: CN105483080A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發(fā)明（設計）人: 彭魯英;王鐸;李麗;栗志剛
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 上海科盛知識產(chǎn)權代理有限公司 31225
• 代理人: 趙志遠

技術領域

本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基，尤其是涉及一種大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基。

背景技術

大鼠胚胎干細胞具有極其重要的科研價值。而大鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)方法由 AustinSmith與應其龍等于2008年所發(fā)明。最早的大鼠胚胎干細胞培養(yǎng)基主要依 靠“3i”抑制劑體系：CHIR99021,PD184352和SU5402。隨后，隨著研究的深入， 應其龍又將“3i”大鼠胚胎干細胞培養(yǎng)體系優(yōu)化為“2i”培養(yǎng)體系：CHIR99021 PD0325901。但是“2i”培養(yǎng)體系培養(yǎng)時間較長，并且不容易獲得大型克隆，同時 其穩(wěn)定性較差。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供一種效果穩(wěn)定、 培養(yǎng)周期短、可獲得大型克隆的大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)：

一種大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基，每40ml的大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基包括 以下成分：

所述的b-巰基乙醇是以DPBS為溶劑的溶液形態(tài)，且b-巰基乙醇溶液的濃度 為55mM。

所述的CHIR99021是以DMSO為溶劑的溶液形態(tài)，且CHIR99021溶液的濃 度為10mM。

所述的PD0325901是以DMSO為溶劑的溶液形態(tài)，且PD0325901溶液的濃度 為10mM。

所述的N-2添加劑為100倍濃度儲存液。

所述的B-27添加劑為無血清的50倍濃度儲存液。

所述的重組小鼠白血病抑制因子為10⁷單位。

作為優(yōu)選，每40ml的大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基還包括以下成分：青鏈霉素 雙抗溶液0.5ml，所述的青鏈霉素雙抗溶液含5000單位青霉素和5000ug鏈霉素。 青鏈霉素雙抗溶液為防止細胞污染而加入，其本身對大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)無顯 著作用，可根據(jù)實際情況決定是否添加。

重組小鼠白血病抑制因子，即recombinantmouseLeukemiaInhibitoryFactor(簡 稱為mLIF，本培養(yǎng)基所使用重組小鼠白血病抑制因子為10⁷單位)。

培養(yǎng)基成分主要作用：

DMEM/F12培養(yǎng)基：此培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)嚙齒類動物細胞，尤其適合對大鼠 和兔子細胞的培養(yǎng)，并被證明在骨髓瘤與雜交瘤細胞培養(yǎng)中可以使細胞處于高質(zhì)量 狀態(tài)。

N-2添加劑：主要用于成神經(jīng)細胞瘤以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)與中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS)的原代細胞培養(yǎng)。N-2添加劑可以替代Bottenstein中的N1添加劑，用于添 加了生長因子bFGF和EGF的Neurobasal培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基。

Neurobasal培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)出生前和胎兒神經(jīng)元細胞。使用時需添加B-27添 加劑。此培養(yǎng)基可用于海馬神經(jīng)元，大腦皮層和大腦其他區(qū)域的神經(jīng)細胞的生長。 此外，該培養(yǎng)基可以在不添加膠質(zhì)細胞飼養(yǎng)層的情況下維持神經(jīng)細胞的同源群落存 活。

B-27添加劑：是無血清添加劑，用于海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS) 神經(jīng)元的生長。該培養(yǎng)基可以與Neurobasal培養(yǎng)基組合使用，在神經(jīng)細胞培養(yǎng)時 省略了飼養(yǎng)層細胞。

L-谷氨酰胺：主要用于細胞培養(yǎng)，可以作為原料合成嘌呤、嘧啶核苷酸，氨基 糖，谷胱甘肽以及谷氨酸，對于細胞生長非常重要。

b-巰基乙醇：可以促使胚胎干細胞分裂，提高獲取囊胚的質(zhì)量。

CHIR99021：CHIR99021可以抑制GSK-3，使胞內(nèi)游離β-catenin增加，激活 經(jīng)典Wnt信號通路。

PD0325901：是非ATP競爭性的MAPK激酶MEK抑制劑。蘇氨酸/酪氨酸激 酶MEK是RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的關鍵組成部分，在胚胎干細胞增殖分 化過程中具有重要作用。PD0325901可精確有效地抑制MEK。

重組小鼠白血病抑制因子：可以維持胚胎干細胞干性狀態(tài)。

在配制培養(yǎng)基時首先將20mlDMEM/F12培養(yǎng)基與0.2mlN-2添加劑(100倍濃 度儲存液)配成混合液1。