[發明專利]一種甘膽酸的測定試劑及其制備方法

在審

• 申請號: 201510929415.1
• 申請日: 2015-12-14
• 公開（公告）號: CN105588936A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 方朝君
• 申請（專利權）人: 浙江達美生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 紹興市越興專利事務所(普通合伙) 33220
• 代理人: 蔣衛東

技術領域

本發明涉及一種甘膽酸的測定試劑及其制備方法，屬于生化手段測試技術領域。

背景技術

血清甘膽酸(Cholyglycine,CG)是膽酸與甘氨酸結合而成的結合型膽酸之一，在 肝細胞內，膽固醇經過極其復雜的酶促反應，轉變成初級膽汁酸。其中有膽酸(CA)和鵝去氧 膽酸(CD-CA)。膽酸的類固醇核上有三個羥基(C3、C7、C12)，側鏈末端的羥基以肽鍵與甘氨 酸結合，分子量為462u。

CG在肝細胞合成，經膽管排入膽囊貯存，餐后膽囊收縮，隨同膽汁排入小腸，參與 脂肪的消化吸收，95％的膽酸由小腸粘膜重吸收入血，經門靜脈輸送至肝臟由肝細胞攝取。 正常情況下，肝臟能有效攝取門靜脈血中99％以上的CG重新泌入膽汁，僅有1％CG溢入體循 環。當肝細胞受損時，肝細胞不能有效攝取經腸肝循環達肝臟的CG，致使血中CG含量增高； 膽汁淤滯時，肝臟排泄膽酸發生障礙而返流入血循環中，也可使血中CG含量增高。

臨床證明：肝損傷的生化指標中CG比谷丙轉氨酶、膽紅素等試驗更敏感，具體如 下：

(1)在急性肝炎、慢性活動性肝炎、原發性肝癌、肝硬化及慢性遷延性肝炎等病癥 中，其血清CG的水平均高于正常對照組，升高陽性率按上述順序遞減，尤其在臨床鑒別慢性 活動性肝炎和慢性遷延性肝炎方面，慢活肝CG升高的幅度和頻率均高于慢遷肝，CG可作為 一項有價值的指標，對判斷慢性活動性肝炎的進展和緩解，預測療效和復發均有很好價值。

(2)血清甘膽酸含量升高程度與肝硬化的病理發展進程呈正相關，是臨床判斷肝 硬化程度和預后的很好的指標。

(3)血清甘膽酸水平在膽結石患者顯著升高，可高達50倍。

(4)梗阻性肝病時，CG水平增高10-20倍，藥物性膽汁郁積癥血清膽酸也增高。

(5)孕婦在懷孕的中后期，由于嬰兒的增大，會壓迫肝臟，使肝臟排泄膽酸發生障 礙而導致CG的偏高，嚴重者可能會導致死胎。

(6)妊娠期肝內膽汁淤積癥(Intrahepaticcholestasisofpregnancy,ICP)又 稱妊娠遲發性膽汁淤積,屬高危妊娠之一。本病雖然無孕婦死亡,但對胎兒有嚴重影響,易 發生早產,胎兒宮內窘迫甚至圍產兒死亡。

目前國內測定甘膽酸的方法主要有：

(1)乳膠增強免疫比濁法，該方法靈敏度較低，易出現前帶現象。

(2)化學發光法，該方法雖然靈敏度高，但不穩定，重復性較差。

(3)酶聯免疫法，該方法定量準確性差，操作時間長，自動化程度低，一般只用于定 性檢測。

基于此，做出本申請。

發明內容

為了克服現有甘膽酸在測試過程中存在的上述缺陷，本發明首先提供一種快速靈 敏、準確性好、特異性高、穩定性好、操作簡便，適用于臨床全自動或半自動生化分析的甘膽 酸測定試劑。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案如下：

一種甘膽酸測定試劑，包括R1試劑、R2試劑和甘膽酸標準樣，所述的R1試劑是由硫 代氧化型輔酶I溶解于添加有緩沖液的純化水中所形成的溶液；所述的R2試劑是由還原型 輔酶I溶解于添加有緩沖液、甘膽酸脫氫酶、疊氮鈉的純化水中所形成的溶液；所述的甘膽 酸標準樣是由甘膽酸鈉水合物、緩沖液和疊氮鈉溶解于純化水中形成的溶液。

進一步的，作為優選：

所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷，更優選的，所述的磷酸鹽緩 沖液的pH為7.0，濃度為0.65mol/L。

所述的硫代氧化型輔酶I為β-硫代煙酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)，其 濃度為1g/L。

所述的還原型輔酶I為β-煙酰胺脲嘌呤二核苷酸還原型(NADH)，其濃度為6g/L。

所述的甘膽酸脫氫酶濃度≥5000U/L。

所述的疊氮鈉濃度為0.6mol/L。

同時，本發明還提供了一種具有上述特征甘膽酸測定試劑的制備方法，包括如下 步驟：

(1)R1試劑配制：向純化水中加入緩沖液，攪拌至完全溶解；加入硫代氧化型輔酶I 攪拌至完全溶解，繼續攪拌后定容；

(2)R2試劑配制：向純化水中加入緩沖液，攪拌至完全溶解；加入甘膽酸脫氫酶，攪 拌至溶解；添加疊氮鈉攪拌至溶解，加入還原型輔酶I攪拌至完全溶解，繼續攪拌后定容；