[發明專利]一種利用等溫核酸擴增技術快速檢測結核分枝桿菌的方法

在審

• 申請號: 201510899042.8
• 申請日: 2015-12-09
• 公開（公告）號: CN105779583A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 陳淑丹;劉偉;何蕾;鮑澤英;郭利川;劉小曼;湯賽君;王智宏;王秀東;應清界
• 申請（專利權）人: 江蘇奇天基因生物科技有限公司;浙江國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測領域，具體涉及一種利用等溫核酸擴增技術快速檢測 結核分枝桿菌的方法。

背景技術

結核病（Tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，M. tb）感染引起的一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，也是由單一致病菌引起死亡數最多 的疾病，能夠感染人和多種哺乳動物及禽類，其中導致人類感染的結核菌大多數是人型結 核分枝桿菌。人體各個器官都可被其侵犯，但以肺結核為多見。其病理特征是在多種組織器 官中形成肉芽腫和干酪樣、鈣化結節病變。該病是伴隨人類歷史最長的疾病之一，早在古希 臘、古埃及時期就有結核病的記載。德國細菌學家柯赫于1882年發現并證實了結核分枝桿 菌是導致結核病的病原菌。目前，全球結核病每年新發病例800萬左右，其中80%集中在發展 中國家。我國結核病疫情的主要特點是感染率高、耐藥率高、患病率高等。結核病已成為全 球重大公共衛生問題和社會問題。

結核分枝桿菌簡稱結核桿菌，屬于分枝桿菌屬（Mycobacterium）。其基因組由共價 閉合環狀DNA組成。結核分枝桿菌為細長、直或微彎的桿菌，單在、少數成叢，大小為0.2-0.5 μm×1.5-4.0μm。菌體兩端有濃染顆粒，無鞭毛，無芽孢，無莢膜。該菌為專性厭氧菌，對營養 要求嚴格。最適pH6.4-7.0，最適溫度為37-37.5^oC。生長緩慢，繁殖一代需18-24小時。對干 燥、冷、酸等理化因素抵抗力較強，但對酒精及紫外線抵抗力較弱。具有一定的變異性，可發 生菌落、形態、毒力及耐藥性等變異，同時對異煙肼、利福平等藥物極易產生耐藥性。結核分 枝桿菌包括人型、牛型、非洲型和鼠型，其中致人發病的主要是人型。結核分枝桿菌的致病 性不依賴內毒素、外毒素及侵襲酶類，而主要與代謝產物的毒性、菌體成分及機體產生的免 疫病理損傷密切相關。

近年來，由于一些客觀因素及人為因素的出現，如人免疫缺陷病（HIV）感染的流 行、艾滋病毒的傳播、人口增長以及多重耐藥性結合分枝菌株的出現等，導致結核病的疫情 在不斷上升。因此，建立快速檢測結核分枝桿菌的方法是必要的。

傳統的結核分枝桿菌檢測方法由于檢測周期長、漏檢率高、程序復雜等缺點，已經 遠遠不能滿足臨床檢測的需求。分子生物學方法如核酸探針技術、基因芯片技術、聚合酶鏈 式反應（PCR）以及等溫核酸技術中的LAMP法已經建立起來，并且在結核分枝桿菌的檢測上 已得到較好的應用，大大縮短了檢測的時間。應用探針技術可以在短期內處理大量樣品，但 由于其敏感性尚不夠高、加之常常需要放射性標記，操作比較繁瑣費時，因而限制了其應 用。PCR技術如實時定量PCR、多重PCR以其高度的特異性及敏感性在結核分枝桿菌檢測方面 取得了重大的突破。但是這些方法需要使用復雜的儀器和裝備精良的實驗室。環介導等溫 核酸擴增技術克服了PCR技術需要昂貴的設備儀器等缺點，具有操作簡便，結果判斷簡單等 優點，已應用于沙門氏菌的檢測。但是，LAMP技術要求多對引物且對靶基因的要求較高。

由于現存結核分枝桿菌檢測方法的不足以及結核分枝桿菌快速實地檢測的需求， 因此研究一種能在基層應用，可簡單快速檢測結核分枝桿菌的擴增方法非常有必要。

本發明中的等溫核酸擴增技術不僅檢測時間短、靈敏度高，并且擺脫了昂貴儀器 的束縛，可以在非實驗室環境下進行，達到現場檢測的目的。此外，該方法操作方便，對人員 要求不高。因此該方法具有很高的推廣應用價值，不僅適合于科研工作，還可以作為設備條 件相對較差的基層單位相關人員進行常規和應急檢測的工具。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用重組酶介導的等溫核酸擴增技術檢測結核分枝桿 菌的方法，該檢測方法的主要步驟是先進行結核分枝桿菌基因組的提取，將結核分枝桿菌 基因組DNA加入到含有特異引物和探針的等溫核酸擴增體系中進行擴增，在等溫條件(35- 45^oC)下，10-20分鐘即可檢測擴增產物。

本發明的具體技術方案如下：

1．獲取結核分枝桿菌DNA，設計結核分枝桿菌的引物和探針，建立結核分枝桿菌等溫核 酸擴增體系，將結核分枝桿菌DNA加入到擴增體系中，再加入反應緩沖液，在等溫條件(35- 45℃)下，10-20分鐘即可檢測到擴增產物。

2．根據上述1所述的方法，建立結核分枝桿菌等溫核酸擴增體系，如下所示：