[發明專利]一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白及其應用

在審

• 申請號: 201510875152.0
• 申請日: 2015-12-02
• 公開（公告）號: CN105440120A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發明（設計）人: 金成浩;臧延青;羅英花;金美華;孫虎男;劉暢
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;A61K38/17;A61P35/00;A61P29/00;A61P19/02
• 代理公司: 北京國智京通知識產權代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白及其應用。

背景技術

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumornecrosisfactorrelatedapoptosis-inducingligand，TRAIL)也稱為凋亡素-2配體(Apo-2L)，是新近發現的腫瘤壞死因子(TNF)基因超家族成員，屬于II型跨膜蛋白(transmembraneprotein)。TRAIL是一個由281個氨基酸構成的II型跨膜蛋白，其中從第114個精氨酸(arginine)到第281個甘氨酸(glysine)的序列為誘導癌細胞凋亡的主要功能區域。它能通過與死亡受體結合選擇性誘導多種腫瘤細胞與轉化細胞發生凋亡，而對正常組織和細胞幾乎沒有不良反應。這一特性使得TRAIL在腫瘤的靶向治療中具有良好的應用前景，被認為是一種非常具有發展潛力的抗腫瘤因子，近年已成為國內外研究的熱點。但單體結構的TRAIL不能誘導細胞凋亡，把TRAIL應用到臨床上仍有許多問題亟待解決。為了實現TRAIL誘導細胞凋亡的目的，現有技術中通過重組TRAIL形成二聚體或多聚體后與死亡受體(DR4，DR5)相結合發揮細胞凋亡的作用，但現有技術中針對重組TRAIL蛋白具有生物活性低、產量低、性質不穩定且易變性的缺點。

發明內容

本發明為了解決上述技術問題，提供一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白及其應用，利用PET表達載體對人類TRAIL基因(114-281序列)進行基因克隆制作出具有N-末端組氨酸標簽(Histidinetag)和異亮氨酸拉鏈基序(Leucinezipper)的TRAIL重組基因本發明為了解決上述技術問題，提供一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白及其應用，利用PET表達載體對人類TRAIL基因(114-281序列)進行基因克隆制作出具有N-末端組氨酸標簽(Histidinetag)和異亮氨酸拉鏈基序(Leucinezipper)的TRAIL重組基因(PET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281，簡稱HZ-TRAIL)。本發明的重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白對抗腫瘤和抗類風濕關節炎具有高藥效的優點。

為了達到上述技術效果，本發明的技術方案包括：

一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白，由TRAIL的114-281氨基酸序列與載體PET進行基因克隆，制備出具有N-末端組氨酸標簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因PET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重組蛋白，簡稱HZ-TRAIL。

所述的重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

所述的重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白適用于在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞中表達。

所述的重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白可誘導癌細胞或炎性淋巴細胞凋亡。

所述的重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白可應用于抗腫瘤藥物中。

所述的重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白可應用于類風濕性關節炎藥物中。

本發明的有益效果包括：

1、本發明一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白及其應用，改善了TRAIL固有的諸多問題比如減少藥物降解及損失，從而延長了TRAIL的半衰期、通過延緩蛋白的排泄，提高其抗酶解的能力，增加其溶解性與穩定性，以及降低其免疫原性，顯著延長了TRAIL的體內生物活性。另外，通過進一步研究證明了HZ-TRAIL在抗腫瘤和抗類風濕關節炎的藥效。

2、本發明一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白HZ-TRAIL可以誘導多種癌細胞的凋亡，而對正常組織和細胞無任何副作用。

3、本發明一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白HZ-TRAIL在RA發病過程中通過誘導炎性淋巴細胞的凋亡，降低炎癥反應，對關節起保護作用。

附圖說明

圖1所示為本發明一種重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的制備方法的模式圖。

圖2所示為本發明野生型TRAIL和實施例2制備出的HZ-TRAIL的SDS-PAGE比較圖。

圖3所示為本發明制備出的HZ-TRAIL對大腸癌細胞(HCT116)殺傷能力圖。

圖4A所示為本發明HZ-TRAIL對子宮癌細胞(HeLa)凋亡和細胞壞死比例柱狀圖；

圖4B所示為本發明HZ-TRAIL對子宮癌細胞(HeLa)形態及顏色變化圖。