[發明專利]一種沉默水稻過氧化氫酶基因OsCAT3的sgRNA

在審

• 申請號: 201510859474.6
• 申請日: 2015-11-27
• 公開（公告）號: CN105255898A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發明（設計）人: 胡麗芳;劉世強;賀浩華;朱昌蘭;彭小松;賀曉鵬;傅軍如;陳小榮;歐陽林娟;邊建民;孫曉棠;徐杰;周大虎
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發明涉及一種抑制OsCAT3基因表達的sgRNA及應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

過氧化氫酶(Catalase，CAT)是生物體內主要的抗氧化酶之一。它通過催化電子的轉移，將H202(過氧化氫)分解為水和氧氣，從而有效清除植物光呼吸、線粒體電子傳遞等過程中產生的H202。CAT家族由多基因編碼，蓖麻子、番茄、菠菜、玉米、棉花、芥子、南瓜、煙草等存在著不同數目的CAT同工酶，少的有2種,多的達數10種。所編碼蛋白主要分布在過氧化物酶體、乙醛酸循環體和細胞質中。CAT基因的表達收干旱、低溫、光照、高鹽、重金屬等非生物因子所誘導。

CAT在植物防御、應答脅迫、細胞氧化還原平衡的控制以及延緩衰老等方面起著重要作用。CAT可做為植物耐旱性鑒定的重要生理指標之一，在玉米中的研究也發現其抗旱性與水分脅迫下CAT等保護酶活性呈顯著正相關抗旱性強的玉米品種，SOD、CAT、GPX等保護酶活性較高。小麥中CAT1和CAT2的表達量隨著干旱條件的不同和晝夜規律的變化而發生改變，尤其在嚴重干旱時表達量顯著增強。高羊茅CAT1能夠清除滲透脅迫下產生的H₂O₂,Northern雜交的時間曲線表明,植株葉片在受到冷和高鹽脅迫時,FaCat1表達量顯著增加,特別是在處理后的2h和4h時,其表達量達到最大。在煙草中過量表達酵母Cat1，經檢測發現轉基因植株抗病毒侵染能力提高,產生的壞死斑比未轉基因植物小。余迪求發現在轉基因馬鈴薯植株體過量的表達過氧化氫酶基因,能夠提高馬鈴薯抗病性。

發明內容

本發明的目的是提供一種抑制水稻過氧化氫酶基因OSCAT3的方法，提供了一種沉默水稻過氧化氫酶基因OSCAT3的sgRNA，及靶向沉默水稻過氧化氫酶基因OSCAT3的載體構建方法。

本發明中，一種沉默水稻過氧化氫酶基因OSCAT3的sgRNA，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。

本發明中，用于沉默水稻過氧化氫酶基因OSCAT3的載體，其特征在于：含有特異性靶向OSCAT3基因第二外顯子的sgRNA的表達載體和Cas9蛋白的體外轉錄載體，其中sgRNA序列上游為水稻U6啟動子，Cas9上游為玉米加強型啟動子，篩選標記為潮霉素。

本發明靶向沉默水稻過氧化氫酶基因OSCAT3的載體構建方法，按以下步驟進行：

(1)根據在線軟件http://crispr.mit.edu/搜尋OsCAT3(LOC_Os02g02400)基因的合適的靶標序列，OsCAT3的序列特征見SEQNO6所示，靶標序列見SEQIDNO.2所示。

(2)將靶標序列去除末端AGG，將其第一位的“C”變為“G”獲得sgRNA序列，其DNA序列見SEQIDNO.1所示；將SEQIDNO.1序列反向互補獲得sgRNA的反向互補序列，其DNA序列見SEQIDNO.3所示。

(3)在sgRNA序列的5端引入6個額外的堿基TGTGTG獲得SEQIDNO.4序列；在sgRNA反向互補序列的5端引入4個額外的堿基AAAC，3端引入2個額外的堿基CA獲得SEQIDNO.5序列。人工合成SEQIDNO.4和SEQIDNO.5的序列后并將其制備成Oligo二聚體；

(4)將制備好的Oligo二聚體連接至BGK03載體U6啟動子上游，然后轉化大腸桿菌DH5a獲得載體BGK03-OSCAT3。

3.本發明的有益效果是載體BGK03-OSCAT3轉化水稻后，即可實現高效、快速、特異對水稻OSCAT3基因進行沉默。轉基因水稻植株呈現生長矮小、穗短，可直接用此做研究材料來探討OSCAT3基因的功能和作用機理，為在生產實踐上更好利用OSCAT3基因進行遺傳改良奠定基礎。

附圖說明

圖1為本發明的水稻OSCAT3基因的目標靶位點。小寫字母代表內含子，大寫字母代表外顯子。

圖2為本發明的轉基因水稻中OSCAT3基因目標靶序列的比對結果。

A為野生型水稻9522，B為轉基因水稻，陰影部分為目標靶序列。

圖3為本發明的轉基因水稻中OSCAT3基因突標靶序列的峰圖。A為野生型水稻9522，B為轉基因水稻，框內所示序列為目標靶序列

圖4為轉基因水稻植株；其中A和C為野生型，B和D為轉基因水稻。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，這些實施例僅用于舉例說明本發明，而不對本發明的范圍構成任何限制。