[發(fā)明專利]一種生物素酶酶活性的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510833796.3
• 申請日: 2015-11-25
• 公開（公告）號: CN105372219A
• 公開（公告）日: 2016-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郝淑靜;劉曉敏;劉衛(wèi)德;胡潔
• 申請（專利權(quán)）人: 北京中科非凡生物技術(shù)有限公司;北京中科醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司;北京和信創(chuàng)新生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;王春霞

1.一種生物素酶酶活性的檢測方法，包括如下步驟：

1)將樣本加入至試劑1和試劑2中進行反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后加入試劑3進行終止反應(yīng)；將所述反應(yīng)后的體系進行離心分離，向得到的上清液中加入試劑4進行中和至pH值為7～11；向所述中和后的體系中加入試劑5進行衍生反應(yīng)；檢測所述衍生反應(yīng)后的體系在激發(fā)波長300～500nm和發(fā)射波長400～600nm下的熒光值；

2)將樣本加入至所述試劑1中進行反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束加入所述試劑2后，立即加入所述試劑3進行終止反應(yīng)；將所述反應(yīng)后的體系進行離心分離，向得到的上清液中加入所述試劑4進行中和至pH值為7～11；向所述中和后的體系中加入所述試劑5進行衍生反應(yīng)；檢測所述衍生反應(yīng)后的體系在激發(fā)波長300～500nm和發(fā)射波長400～600nm下的熒光值，作為空白對照的熒光值；

所述反應(yīng)與步驟1)中所述反應(yīng)的條件相同；

所述終止反應(yīng)與步驟1)中所述終止反應(yīng)的條件相同；

所述衍生反應(yīng)與步驟1)中所述衍生反應(yīng)的條件相同；

3)將至少8種不同濃度的賴氨酸分別與所述試劑5進行所述衍生反應(yīng)，并檢測所述衍生反應(yīng)后的體系在激發(fā)波長300～500nm和發(fā)射波長400～600nm下的熒光值；以賴氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，以熒光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；

所述衍生反應(yīng)與步驟1)中所述衍生反應(yīng)的條件相同；

4)根據(jù)步驟1)中所檢測的熒光值與步驟2)中作為空白對照的熒光值的差值和所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到步驟1)中進行所述衍生反應(yīng)的賴氨酸的濃度，進而得到所述樣本中生物素酶的酶活性；

所述酶活性的單位定義為：以每L樣本每小時水解所述生物胞素生成的賴氨酸的微摩爾數(shù)，表示為μmol/L/h；

所述試劑1為由緩沖液1和酶活穩(wěn)定劑組成的緩沖體系，所述試劑1的pH值為3～11；

所述試劑2為生物胞素；

所述試劑3為終止液；

所述試劑4為中和液；

所述試劑5為由緩沖液2和衍生底物組成的體系，所述衍生底物為1,2-二乙酰苯、茚三酮、熒光胺和鄰苯二醛中任一種。

2.試劑盒在制備檢測生物素酶酶活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

所述試劑盒包括獨立包裝的試劑1、試劑2、試劑3、試劑4和試劑5；

所述試劑1為由緩沖液1和酶活穩(wěn)定劑組成的緩沖體系，所述試劑1的pH值為3～11；

所述試劑2為生物胞素；

所述試劑3為終止液；

所述試劑4為中和液；

所述試劑5為由緩沖液2和衍生底物組成的體系，所述衍生底物為1,2-二乙酰苯、茚三酮、熒光胺和鄰苯二醛中任一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法或權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述試劑1中，所述緩沖液1的摩爾濃度為50～500mmol/L，所述酶活穩(wěn)定劑的摩爾濃度為1～50mmol/L；

所述試劑2中，所述生物胞素的摩爾濃度為0.05～2mmol/L；

所述試劑3中，所述終止液的質(zhì)量百分含量為30％～70％；

所述試劑4中，所述中和液的摩爾濃度為0.2～2mol/L；

所述試劑5中，所述緩沖液2的摩爾濃度為50～500mmol/L，所述衍生底物的質(zhì)量百分含量為0.05％～5％。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的檢測方法或權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述緩沖液1和所述緩沖液2均選自下述緩沖試劑中至少一種：

a)乙酸鈉-乙酸緩沖液，pH為2.6-5.8、b)甲酸鈉-甲酸緩沖液，pH為2.0-5.0、c)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH為3.0-6.6、d)磷酸氫鹽-檸檬酸緩沖液，pH為2.2-8.0、e)磷酸氫鹽-檸檬酸鹽緩沖液，pH為2.2-8.0、f)磷酸鹽緩沖液，pH為4.9-8.2、g)檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液，pH為2.2-6.5、h)Tris-鹽酸緩沖液，pH為7.1-8.9、i)甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH為8.6-10.6和j)碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH為9.16-10.83。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或3或4所述的檢測方法或權(quán)利要求2或3或4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述酶活穩(wěn)定劑為MgSO₄、MgCl₂、乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白、甘油和二甲基亞砜中至少一種。