[發(fā)明專利]一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的血管活性腸肽I型受體抑制劑高通量篩選方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510828140.2
• 申請(qǐng)日: 2015-11-20
• 公開（公告）號(hào): CN105466897A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嚴(yán)明;沈靈;孫丹丹;何玲;張陸勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥理學(xué)領(lǐng)域，利用熒光檢測(cè)技術(shù)，構(gòu)建了血管活性腸肽I型受體抑制劑的高通量篩選模型，用于待測(cè)樣品對(duì)血管活性腸肽I型受體抑制活性的高通量檢測(cè)。

技術(shù)背景

血管活性腸肽I型受體是神經(jīng)多肽與血管活性腸肽的共同受體，介導(dǎo)多種重要的生物學(xué)功能，如血管活性腸肽I型受體介導(dǎo)神經(jīng)多肽與血管活性腸肽抑制食欲和抗炎的生物學(xué)功能。血管活性腸肽I型受體在大腦和T細(xì)胞大量表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化和T細(xì)胞活化。血管活性腸肽I型受體作為血管活性腸肽受體其中一種亞型，在多種腫瘤細(xì)胞表面高水平表達(dá)，而低表達(dá)或不表達(dá)于正常組織細(xì)胞，并在腫瘤的進(jìn)展和血管生成中發(fā)揮重要作用，是一具潛在應(yīng)用價(jià)值的分子影像診斷和治療靶標(biāo)，所以篩選血管活性腸肽I型受體拮抗劑具有重要應(yīng)用價(jià)值。

時(shí)間分辨熒光技術(shù)(time-resolvedfluorescence，TRF)是基于鑭系元素如銪(Eu)、釤(Sm)、鏑(Dy)等具有較長(zhǎng)熒光壽命的特點(diǎn)發(fā)展而來的。當(dāng)銪螯合物供體與受體之間距離小于10nm，且供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜有重疊時(shí)，則發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，均相時(shí)間分辨熒光(homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技術(shù)是法國(guó)Cisbio公司利用這一原理進(jìn)行深入開發(fā)的產(chǎn)品。大多數(shù)熒光物質(zhì)的熒光壽命非常短(一般為幾毫秒)，為了避免短暫的熒光干擾，Cisbio公司利用較長(zhǎng)熒光壽命的鑭系螯合物作為熒光能量供體，受體經(jīng)過別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin)或熒光素修飾，供體在能量轉(zhuǎn)移時(shí)就可以使受體也具有較長(zhǎng)的熒光壽命。因此，能量轉(zhuǎn)移時(shí)受體發(fā)射光消失時(shí)間與供體發(fā)射光消失時(shí)間成正比，而與供受體間的距離成反比，這種方法延長(zhǎng)了熒光檢測(cè)時(shí)間，降低了短暫熒光引起的背景干擾。

實(shí)驗(yàn)中利用血管活性腸肽I型受體和Gs蛋白耦聯(lián)，激活A(yù)C，使cAMP含量增加，會(huì)產(chǎn)生帶有熒光的產(chǎn)物，通過熒光強(qiáng)弱來判斷血管活性腸肽I型受體的作用，從而得出化合物是否有抑制血管活性腸肽I型受體作用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)血管活性腸肽I型受體抑制劑的高通量篩選模型的建立。

目前，少有對(duì)于血管活性腸肽I型受體抑制劑的篩選方法，因此，建立方便快捷準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，特別是體外的功能性檢測(cè)在藥物篩選中越來越受到重視。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于建立一種基于熒光的血管活性腸肽I型受體抑制劑高通量篩選模型，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點(diǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：采用熒光方法建立體外血管活性腸肽I型受體抑制劑高通量篩選模型，初篩，復(fù)篩發(fā)現(xiàn)一類具有抑制血管活性腸肽I型受體活性的候選化合物。具體步驟如下：

本發(fā)明利用熒光的方法建立了一種血管活性腸肽I型受體抑制劑高通量篩選模型。

步驟一：血管活性腸肽I型受體抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化。

步驟二：陽(yáng)性藥驗(yàn)證模型可靠性。

步驟三：高通量篩選模型驗(yàn)證。

附圖說明：

圖1：血管活性腸肽I型受體細(xì)胞濃度梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(n＝1，)

圖2：VIP濃度梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(n＝1，)

圖3：陽(yáng)性藥VIP(1-7)-GRF(8-27)對(duì)血管活性腸肽I型受體的抑制曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式：

一、血管活性腸肽I型受體抑制劑篩選方法建立

1、實(shí)驗(yàn)材料

d2-cAMP檢測(cè)試劑盒(Cisbio，法國(guó))、VIP(Sigma-aldrich，美國(guó))、VIP(1-7)-GRF(8-27)(Sigma-aldrich，美國(guó))、DMEM、FBS(Gibco，美國(guó))384孔聚丙烯微孔板Cat#3573(Corning，美國(guó))、一次性槍頭(Axygen，美國(guó))

2、實(shí)驗(yàn)步驟

1)血管活性腸肽I型受體細(xì)胞最適濃度確定

1)配制不同濃度的血管活性腸肽I型受體細(xì)胞，每孔加入5μl。

2)每孔加入5μl含VIP的1×反應(yīng)buffer。

4)室溫反應(yīng)45分鐘。

5)加入10μl×終止buffer，室溫孵育1小時(shí)。檢測(cè)熒光強(qiáng)度，確定最適血管活性腸肽I型受體細(xì)胞濃度(見圖2)。

(2)VIP最適濃度確定