[發(fā)明專利]一種提高轉(zhuǎn)基因雞孵化率的方法及使用的蛋殼開(kāi)口器

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510821124.0
• 申請(qǐng)日: 2015-11-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105274145A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-01-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐廷生;雷雪芹;史明艷;李振紅;宋禎;王攀林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/89
• 分類號(hào): C12N15/89;C12M1/00
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務(wù)所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛(ài)軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提高轉(zhuǎn)基因雞孵化率的方法，同時(shí)還涉及該方法使用的蛋殼開(kāi)口器，屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。雞具有世代周期短、低成本、繁殖力高、卵中天然存在著蛋白酶抑制劑和良好的無(wú)菌環(huán)境，表達(dá)的重組蛋白易提純、效益高等優(yōu)點(diǎn)，因此轉(zhuǎn)基因雞的研究是目前科學(xué)研究的熱點(diǎn)和生物制藥領(lǐng)域的新興產(chǎn)業(yè)之一。胚盤(pán)顯微注射法是制備轉(zhuǎn)基因雞的常用手段，其中雞蛋開(kāi)窗法是雞胚盤(pán)顯微注射法的的關(guān)鍵技術(shù)之一，它在很大程度上決定了轉(zhuǎn)基因雞的孵化率。胚盤(pán)顯微注射法必須在種蛋上打開(kāi)一個(gè)小窗，這就無(wú)可避免的破外了雞蛋外殼的正常結(jié)構(gòu)，改變了蛋殼內(nèi)外的壓力平衡和雞胚發(fā)育的內(nèi)環(huán)境，從而造成雞胚的非正常死亡。同時(shí)，開(kāi)窗處理使蛋殼受損，極易造成雞胚受到污染，大大降低了孵化率。因此，研發(fā)出一種行之有效的提高轉(zhuǎn)基因雞孵化率的方法具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種提高轉(zhuǎn)基因雞孵化率的方法及使用的蛋殼開(kāi)口器，能夠有效提高轉(zhuǎn)基因雞的孵化率。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種提高轉(zhuǎn)基因雞孵化率的方法，包括以下步驟：

(1)孵化器的消毒及種蛋的預(yù)孵化處理

對(duì)孵化器進(jìn)行消毒，種蛋進(jìn)行預(yù)孵化處理，放入孵化箱內(nèi)開(kāi)始孵化；1-18d的孵化溫度為37.8℃，濕度為60％，19-21d的孵化溫度為37℃，濕度為78％；

(2)種蛋的開(kāi)口

開(kāi)口前將蛋殼開(kāi)口器和無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行消毒，將孵化12-24h的種蛋從孵化箱內(nèi)取出，在種蛋的赤道位置先用碘酊后用75％酒精擦拭消毒，用砂輪在蛋殼赤道面處研磨，一邊研磨一邊用酒精棉球擦拭蛋殼碎末，直至蛋殼赤道面上出現(xiàn)開(kāi)口，觀察雞胚孵育情況；

(3)外源基因的注射

將開(kāi)口后的雞蛋，開(kāi)口向上，放在操作臺(tái)內(nèi)靜置2min，使雞胚盤(pán)的位置漂浮在雞蛋的開(kāi)口處，將含有外源基因的轉(zhuǎn)染液注射入雞的胚盤(pán)中，用抗生素對(duì)開(kāi)口處進(jìn)行殺菌；

(4)種蛋的封口

種蛋的封口采用蛋清+蛋殼膜封口的方法，封口后放入孵化箱繼續(xù)孵化；其中蛋清+蛋殼膜封口的方法為：將蛋殼膜在蛋清中潤(rùn)洗，然后在開(kāi)口處覆蓋第一層蛋殼膜，再在第一層蛋殼膜上交叉覆蓋第二層蛋殼膜。

優(yōu)選的，第一層蛋殼膜和第二層蛋殼膜呈十字形交叉覆蓋。

步驟(1)中孵化器的消毒方法為：將孵化器進(jìn)行清洗，關(guān)閉進(jìn)出氣孔和風(fēng)機(jī)，按照每立方米空間高錳酸鉀10g，福爾馬林15mL的比例依次加入高錳酸鉀和福爾馬林，混合，當(dāng)混合溶液冒煙時(shí)，關(guān)閉孵化器門(mén)，消毒1h，消毒溫度為15-20℃，濕度≥75％；

步驟(1)中種蛋的預(yù)孵化方法為：將新潔爾滅和水按照質(zhì)量比1:1000的比例配制成新潔爾滅溶液，其中水溫為30℃，將種蛋浸入新潔爾滅溶液中5min，洗凈，取出，用脫脂棉擦拭干凈。

步驟(3)中抗生素的制備方法：將青鏈霉素加入生理鹽水中，使其終濃度為0.1μg/μL。

所述外源基因?yàn)楸磉_(dá)載體pEGFP-N1-p53/MAR，是將人抑癌基因p53和雞的核基質(zhì)附著區(qū)MAR基因插入表達(dá)載體中構(gòu)建而成，包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

所述表達(dá)載體pEGFP-N1-p53/MAR的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)抽取癌癥病人的外周血液，提取外周血液總RNA，設(shè)計(jì)上下游引物Primera、Primerb，RT-PCR擴(kuò)增人抑癌基因p53，瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物并純化回收；

RT-PCR反應(yīng)體系為：2×PCRBuffer22μL，上下游引物各1.5μL，RT/TaqMasterMix2μL，總RNA模板3μL；

RT-PCR反應(yīng)條件為：①cDNA合成和預(yù)變性：40℃、30min，94℃、2min；②PCR擴(kuò)增共40個(gè)循環(huán)：94℃預(yù)變性30s、前5個(gè)循環(huán)65℃退火30s，后35個(gè)循環(huán)68℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min，反應(yīng)結(jié)束；

(2)將質(zhì)粒pMD18-T與人抑癌基因p5316℃連接過(guò)夜，得到連接產(chǎn)物pMD18-T-p53；將連接產(chǎn)物pMD18-T-p53轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)，根據(jù)上下游引物Primera、Primerb，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性菌落，提取連接產(chǎn)物pMD18-T-p53，再進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定，鑒定正確的為重組質(zhì)粒pMD18-T-p53；