[發明專利]3型鴨甲肝病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201510792207.1
• 申請日: 2015-11-17
• 公開（公告）號: CN105256073A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發明（設計）人: 汪銘書;胡琴;程安春;楊喬;朱德康;陳舜;賈仁勇;孫昆峰;劉馬蜂;吳英;陳孝躍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及3型鴨甲肝病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及方法。

背景技術

鴨病毒性肝炎是危害養鴨業的一種重要傳染病，其主要致病因子是小RNA病毒，即小RNA病毒科禽肝病毒屬的鴨甲型肝炎病毒(duckhepatitisAvirus，DHAV)。根據全基因組序列分析，鴨甲型肝炎病毒可分為3個獨立的基因型，基因A型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-A)、基因B型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-B)和基因C型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-C)；根據血清學中和實驗，這3個基因型無血清交叉，故分別對應3個不同的血清型，血清1型鴨甲肝病毒(DHAV-1)、血清2型鴨甲肝病毒(DHAV-2)和血清3型鴨甲肝病毒(DHAV-3)。其中，DHAV-A代表傳統的流行毒株，DHAV-B代表臺灣新型病毒株，DHAV-C代表近年來我國和韓國等國家和地區新出現的流行毒株，且DHAV-C毒株在我國流行范圍日趨廣泛。由于3個基因型病毒所引起的疾病在臨床癥狀、病理變化上較為相似，給鑒別帶來很大困難，所以對于DHAV-3的快速準確檢測對于鴨病毒性肝炎的預防與控制具有重要意義。

目前關于DHAV的檢測方法，國內外報道較多的包括血清中和試驗、瓊脂擴散試驗和ELISA等，這些傳統檢測方法存在耗時長、敏感性較低、不易標準化等缺點，在實際應用中具有一定的局限性，在臨床上常常因為不能對其及時做出正確的診斷和有效防制而造成巨大的經濟損失。而實時熒光定量RT-PCR技術憑借其操作簡單、結果直觀、敏感性高、特異性強、重復性好及病原定量等優勢，近年來在動物疫病檢測中得以廣泛應用。因此建立和優化熒光定量RT-PCR方法，不僅為確定鴨病毒性肝炎致病因素提供了一種鑒別檢測方法，同時也為DHAV-3的流行病學調查提供了一種重要技術手段。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種敏感性好、特異性高、準確可靠、快速簡便的檢測血清3型鴨甲型肝炎病毒的一步法熒光定量RT-PCR試劑盒及方法，所述方法利用TaqMan探針技術，能對DHAV-3的核酸進行準確定量檢測。

本發明采取的技術方案如下：

1、3型鴨甲肝病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測引物對、探針，所述引物對由核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的下游引物組成，所述探針的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。

2、含有所述3型鴨甲肝病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測引物對、探針的試劑盒。

優選的，所述試劑盒反應液按總體積20μL計，由以下組分組成：2×onestepRT-PCRBuffer10μL，RTEnzymeMix0.4μL，E×TaqHSDNA聚合酶0.4μL，20pmol/μL的上游引物0.4μL，20pmol/μL的下游引物0.4μL，10pmol/μL的探針0.8μL，RNA模版2μL，最后用RNaseFreedH₂O補至20μL。

優選的，所述試劑盒還包括陰性對照和陽性對照，所述陽性對照為DHAV-3的RNA，所述陰性對照為健康鴨肝臟、健康鴨胚尿囊液及胚體的RNA。

3、利用所述試劑盒檢測3型鴨甲肝病毒的方法，熒光定量RT-PCR的反應條件為42℃5min，95℃10s(一個循環)；95℃5s，54℃15s，反應進行45個循環，于54℃進行熒光信號采集；用FQ-PCR儀自帶軟件自動分析讀取FQ-PCR檢測結果，以獲得擴增曲線，若出現Ct<35且呈對數增長的特異性擴增曲線，則說明樣品中含有3型鴨甲肝病毒；若未出現Ct<35且呈對數增長的特異性擴增曲線，則說明樣品中不含3型鴨甲型肝炎病毒。

本發明的有益效果在于：采用本發明所述試劑盒可用于廣泛檢測3型鴨甲肝病毒，檢測時間短，檢測成本低，重復性好，靈敏度高；本發明檢測的靶點具有單一特異性，提供的引物對和探針對不含目的基因的樣品，均無擴增信號，具有良好的特異性；另外，引物對和探針檢測RNA靈敏度分別可達48copies/μL，具有良好的靈敏度。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：

圖1DHAV-3檢測的定量標準曲線，Y＝-3.373X+44.261，R²＝0.996，擴增效率為97.9％，表明誤差小，可信度高。