[發明專利]一種調控基因在非分泌型腺毛中表達的啟動子及其應用

在審

• 申請號: 201510729014.1
• 申請日: 2015-10-30
• 公開（公告）號: CN105177007A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發明（設計）人: 唐克軒;陳俏;沈乾;付雪晴;石璞;孫小芬;顏廷祥
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

技術領域

本發明涉及植物生物技術領域，具體涉及一種在植物非分泌型腺毛中特異表達的萜類合成酶基因啟動子(proTPS7)及其在轉基因植物中的應用。

背景技術

青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿屬一年生草本植物，植株有濃烈的揮發性香氣，從青蒿腺毛中提取的青蒿精油含有大量具有藥理學或者生物滅殺活性的萜類化合物和黃酮類化合物。青蒿的葉片表面有兩種腺毛：分泌型腺毛(glandularsecretorytrichome，GST)和非分泌型腺毛(Tshapetrichome，TST)，兩種腺毛對于植物的生長、發育、防御和花粉傳播等都起到至關重要的作用。青蒿素(Artemisinin)是從其地上部分分離出的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前抗瘧藥中效果最好、毒性最低的藥物。青蒿素聯合療法(Artemisinin-basedcombinationtherapies，ACTs)已成為世界衛生組織推薦的治療。目前青蒿素的主要來源是從青蒿的地上部分提取，然而，青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，這使得這種藥物的大規模商業化生產受到了極大限制。

啟動子是位于結構基因5'端上游的特定核酸序列，能夠調控下游基因的表達，啟動子就像一個“開關”，通過順式作用元件和反式作用因子的相互作用來發揮其特定的功能。啟動子一共分三種：組成型啟動子、特異型啟動子、誘導型啟動子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用組成型啟動子，例如花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)，這種啟動子能夠驅動外源基因在所有的組織和器官中表達，會過度消耗細胞內的物質和能量，并且不能在時間和空間上調控目的基因的表達，極可能會對植物的正常生長造成一定的負擔和危害。

因此，本領域的技術人員致力于開發一種在植物的組織器官中特異性表達的啟動子來代替組成型啟動子，從而更好的對植物基因的表達進行調控。

發明內容

有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是提供一種在植物的組織器官中特異性表達的啟動子，從而在時間和空間上調控目的基因的表達，從而用以深入研究非分泌型腺毛的發生和發育以及其中的次級代謝產物的代謝調控。

本發明的一方面提供了一種調控基因在非分泌型腺毛中表達的啟動子，該啟動子的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。該啟動子為既是誘導型啟動子，又是特異型啟動子。該啟動子為萜類合成酶基因啟動子。

進一步地，該啟動子上的順式作用元件包括：CGTCA-motif、HSE、MBS、MRE、TC-richrepeats、WUN-motif。

本發明的另一方面提供了一種制備上述調控基因在非分泌型腺毛中表達的啟動子的方法，包括以下步驟：

步驟一、從青蒿基因組中克隆該啟動子的基因組序列；其中，青蒿基因組從培養的青蒿無菌苗中獲得；

步驟二、分析該啟動子上的順式作用元件，確定該啟動子類型；

步驟三、將步驟一中獲得的該啟動子的序列與載體連接；

步驟四、將步驟三中獲得的載體轉化根癌農桿菌；

步驟五、將步驟四中獲得的帶有上述載體的根癌農桿菌穩定轉化植物；該植株為青蒿；

步驟六、檢測上述啟動子的轉入，并確定上述啟動子所引導的基因在植株中的表達部位；檢測啟動子轉入的方法為PCR檢測，啟動子引導的基因為GUS報告基因。

進一步地，上述制備方法中，步驟一包括以基因組DNA為模板，采用兩輪巢式PCR方法擴增所述啟動子序列；其中，巢式PCR的引物為：

進一步地，上述制備方法中，步驟三中的載體為pCAMBIA1391z，利用引物對1391z-proTPS7-F和1391z-proTPS7-R，通過PCR在獲得的啟動子序列中引入酶切位點PstI和NcoI，從而連接到載體pCAMBIA1391z上，其中引物序列如下所示：1391z-proTPS7-F：5’-AACTGCAGAAGAGAAAGCTACATACAATGGGAA-3’；1391z-proTPS7-R：5’-CATGCCATGGGGAGAAAGATCGGTTATGC-3’。

進一步地，上述制備方法中，步驟五包括：1)外植體的預培養；2)農桿菌與外植體的共培養；3)抗性再生植株的篩選。

本發明還提供了一種載體，該載體連接有上述調控基因在非分泌型腺毛中表達的啟動子。

本發明還提供了一種表達盒，該表達盒包括上述調控基因在非分泌型腺毛中表達的啟動子。