[發(fā)明專利]一種檢測(cè)乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510694787.0
• 申請(qǐng)日: 2015-10-23
• 公開（公告）號(hào): CN106610426A
• 公開（公告）日: 2017-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜霞;洪霞;劉靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/535
• 分類號(hào): G01N33/535
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測(cè)大米中乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒。

背景技術(shù)

乙草胺是廣譜、保護(hù)性殺菌劑。作用機(jī)理是能與真菌細(xì)胞中的三磷酸甘油醛脫氫酶發(fā)生作用，與該酶中含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而破壞該酶活性，使真菌細(xì)胞的新陳代謝受破壞而失去生命力。乙草胺沒有內(nèi)吸傳導(dǎo)作用，但噴到植物體上之后，能在體表上有良好的黏著性，不易被雨水沖刷掉，因此藥效期較長(zhǎng)。因此定期對(duì)乙草胺殘留進(jìn)行檢測(cè)成為許多國(guó)家的監(jiān)控的必要手段。

酶聯(lián)免疫吸附法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測(cè)方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)行業(yè)。本發(fā)明旨在建立一種檢測(cè)乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服色譜法的不足，本發(fā)明提供一種檢測(cè)乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的快速檢測(cè)。

本發(fā)明檢測(cè)乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括酶標(biāo)板、乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品、乙草胺抗體工作液、乙草胺酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。

本發(fā)明檢測(cè)乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備，包括以下步驟：酶標(biāo)板的制備、乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品的制備、乙草胺抗體工作液的制備、乙草胺酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。

其進(jìn)一步特征在于：所述的酶標(biāo)板經(jīng)由乙草胺抗原包被制備，具體步驟是將乙草胺半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將乙草胺包被抗原稀釋成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入經(jīng)稀釋的濃縮洗滌液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4℃條件下保存。

乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。

所述乙草胺抗體工作液是采用乙草胺人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。

所述乙草胺酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5% 吐溫-20，0.1 mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。

檢測(cè)乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，基于抗原抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法包括以下步驟：

(1)預(yù)處理待測(cè)樣品，即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液中；

(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；

(3)取包被有乙草胺抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μL/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入乙草胺酶標(biāo)二抗工作液，50 μL/孔，然后加入乙草胺抗體工作液，50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；

(4)小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260 μL/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；

(5)加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15～20 min；

(6)加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630 nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值（請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）；

(7)以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中乙草胺的含量。