[發明專利]基于核酸適配體檢測卡那霉素的電化學傳感器及其制備方法

在審

• 申請號: 201510652510.1
• 申請日: 2015-10-10
• 公開（公告）號: CN105158320A
• 公開（公告）日: 2015-12-16
• 發明（設計）人: 王玉;王虹智;黃加棟;劉素;郭玉娜;許穎;邱婷婷;崔潔;崔雪君;冷雪琪;韓聰;裴倩倩
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 張世靜

技術領域

本發明涉及電化學傳感器技術領域，特別涉及基于目標誘導的核酸適配體構象變化檢測卡那霉素的電化學生物傳感器，還涉及其制備方法。

背景技術

卡那霉素（Ka）是一種氨基糖苷類抗生素，是由鏈霉菌的發酵產生的，被廣泛用于治療誤譯誘導的感染和間接抑制蛋白質合成期間易位。和其他氨基糖甙類一致，Ka可以在動物體中累積并且轉移到食物鏈中，這可能對人類健康引起潛在的危險，比如出現失去聽力，腎臟毒性和藥物過敏反應。歐盟組織已經確定了可食用組織和牛奶中Ka的最大殘留量。目前報道的檢測Ka的方法包括高效液相色譜法，毛細管電泳法，表面等離子體共振方法和熒光共振方法。這些方法有檢測成本高，儀器操作復雜，需要專業操作人員等缺點，因此，確立一個靈敏的高選擇性的方法臨床診斷和在食品安全分析中檢測Ka是至關重要的。

發明內容

為了解決以上現有技術中檢測卡那霉素的方法特異性和靈敏度都比較低、成本高的問題，本發明提供了一種特異性和靈敏度高、成本低、檢測速度快的基于目標物誘導的核酸適配體構象變化檢測卡那霉素的生物傳感器。同時還涉及其制備方法。

所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）對電極進行預處理；

（2）將HAP2與Helper的混合液修飾到電極表面；

（3）將均相反應產物層修飾到電極表面。

所述的制備方法，優選將HAP2與Helper的混合液修飾到電極表面的操作步驟如下：將10μL的10μM的HAP2與Helper的混合液滴加到經過預處理的電極表面，在37℃下孵育2h。

所述的制備方法，優選將均相反應產物修飾到電極表面的操作步驟如下：

（1）將滅菌水，10×的buffer緩沖液、HAP1,Primer，phi29DNA聚合酶，dNTPs，Nt.AlwI內切酶和待測目標物加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

（2）將孵育好的混合混合溶液放在65℃的恒溫箱中孵育5min，使phi29DNA聚合酶與Nt.AlwI內切酶失活；

（3）將（2）中的混合溶液與ExoⅢ一同滴加到修飾好HAP2與Helper的混合液的電極上，將電極繼續放在37℃的恒溫箱中孵育2h，清洗。

所述的制備方法，優選對電極進行預處理操作為，電極在0.3和0.05μm的氧化鋁漿中進行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水沖洗。

所述的制備方法，優選所述電極為金電極。

該發明的檢測方式是電化學檢測，利用傳統的三電極體系。Ag/AgCl為參比電極，鉑絲為對電極，修飾的金電極為工作電極。在檢測之前，先通過Au-S鍵將HAP2與Helper的混合液固定在電極表面。然后將反應后的均相溶液與ExoⅢ一起修飾到電極表面，然后在37℃孵育2h完成電極表面的循環放大過程。最后使電極上的HAP折疊成發夾構象，電活性物質（MB）靠近電極表面。然后用三電極工作體系檢測MB的氧化還原峰。以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設置為0到-0.5V，脈沖寬度0.05V，掃描速率為0.06S，采用差分脈沖伏安技術讀取MB電信號的變化，檢測待測目標物。

本發明中一共用到了4條DNA鏈，其序列分別是：

HAP1：5′-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGACTCAGAGATCCATATGGAACCCCCA-3’(SEQ:ID:NO:1)；

Primer：5’-TGGGGGTT-3’(SEQ:ID:NO:2)；

HAP2：5’-MB-GCTTAGCCTCAACCCATTGTTCTAAGCTTTT-SH-3’(SEQ:ID:NO:3)；

Helper：5’-GGGTTGAGGCTAAGCCGACT-3’(SEQ:ID:NO:4)；

其中HAP1的下劃線標注部分是目標物卡那霉素的aptamer，點下劃線標注的是內切酶Nt.AlwI的識別序列。HAP2的3’端修飾-SH，通過Au-S共價鍵將HAP2固定在金電極表面，5’端修飾電活性物(MB)，可以在一定的電位下發生氧化還原反應。通過測量MB信號的變化來定量檢測卡那霉素。