[發明專利]指示肉蓯蓉生藥材總苷含量范圍的快速檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201510648363.0
• 申請日: 2015-10-09
• 公開（公告）號: CN105274218B
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: 宋述慧;陳婷婷;李語麗;王西亮;姚富文
• 申請（專利權）人: 中國科學院北京基因組研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 趙慧;魏忠暉

1.一種指示肉蓯蓉生藥材總苷含量范圍的快速檢測方法，其特征在于：采用實時熒光定量PCR法測定肉蓯蓉生藥材中下述引物序列所對應基因的表達：

SEQ1：正向引物GCAGCGCCATTATTTGAAC，反向引物AGAGGGGACATGAATCACC；

SEQ2：正向引物GCAGACATGGATGCCCTAC，反向引物TAATTTGGCTGCTCCAAGC；

SEQ3：正向引物GACGGCCAAGCTCTTAGTG，反向引物CTTCCAACATAGCCCACG；

SEQ4：正向引物CCCTTTACGCTCGTTTGG，反向引物TGAATCAAAGACGGTGGAAC；

其中基因SEQ2為與總苷含量呈正相關，基因SEQ1和基因SEQ3呈負相關；基因SEQ4為內參基因；

其包括下述步驟：

(1)RNA提取及cDNA反轉：提取待測肉蓯蓉的總RNA，RNA經純化后進行逆轉錄反應；

(2)PCR擴增：對提取RNA的SEQ1、SEQ2和SEQ3進行RT-qPCR反應，SEQ4作為內參基因；

(3)計算總苷含量：

A、將生藥材分別分為3個等級，內蒙古阿拉善盟右旗為G₁ 0～2.5％、G₂ 2.5％～6.8％和G₃ 6.8％～14.6％，內蒙古阿拉善盟左旗為G₁ 0～1.2％、G₂ 1.2％～2.5％和G₃ 2.5％～6.0％；

B、根據PCR擴增得到的CT值，采用式(Ⅰ)計算SEQ1、SEQ2和SEQ3三個基因的ΔCT；記為分別與SEQ1、SEQ2、SEQ3對應的n₁、n₂、n₃；

n_x＝2^-ΔCT＝2^{-(CT(所測基因)-CT(內參基因))} (Ⅰ)

其中，x＝1、2、3，分別對應SEQ1、SEQ2、SEQ3；

C、將n₁、n₂、n₃分別與N_i1、N_i2、N_i3按照公式(Ⅱ)計算P_i；

其中，i＝1、2、3，分別對應G₁、G₂、G₃；

內蒙古阿拉善盟右旗中：N₁₁＝0.04、N₁₂＝3.33、N₁₃＝0.38，N₂₁＝0.01、N₂₂＝8.02、N₂₃＝0.06，N₃₁＝0、N₃₂＝21.33、N₃₃＝0.02；

內蒙古阿拉善盟左旗中：N₁₁＝0.02、N₁₂＝1.63、N₁₃＝0.01，N₂₁＝0.01、N₂₂＝4.50、N₂₃＝0.04，N₃₁＝0、N₃₂＝9.64、N₃₃＝0.01；

D、比較P₁、P₂、P₃，總苷含量處于最小P_i所對應的G_i的范圍內。

2.根據權利要求1所述的指示肉蓯蓉生藥材總苷含量范圍的快速檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)PCR擴增的反應條件為：95℃、2min，95℃、15s，然后56℃、30m，72℃、30s；共40個循環。