[發明專利]一株連翹內生細菌LQ-A及其分離、純化方法和應用

在審

• 申請號: 201510638009.X
• 申請日: 2015-09-30
• 公開（公告）號: CN105296382A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: 牛明福;張婷婷;萬鵬;盧雪;雷俊紅;司晶麗;馬軼芳
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23B5/16;A23B5/06;C12R1/125
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 羅民健

技術領域

本發明涉及一株連翹內生細菌，具體的說是一株連翹內生細菌LQ-A及其分離、純化方法和應用。

背景技術

連翹出自《神農本草經》，其別名又有旱連子、空翹、落翹、黃奇丹，為木犀科植物連翹Forsythiasuspense的干燥果實，是中國臨床常用傳統中藥之一，具有有抗菌、強心、利尿、鎮吐等藥理作用，常用其治療急性風熱感冒、淋巴結結核、尿路感染等癥，有廣譜抗菌作用，是各中藥復方（為雙黃連口服液、清熱解毒口服液、銀翹解毒沖劑）中的主要組成藥物，國內外已對連翹葉化學成分進行了相關研究，然而對連翹內生菌的研究甚少，對連翹內生菌代謝產物的研究更是微乎其微。

發明內容

本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種連翹內生細菌LQ-A及其分離、純化方法和應用。

一株連翹內生細菌LQ-A，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2015年05月13日，保藏編號為CGMCCNo.10805。

所述的連翹內生細菌LQ-A的分離與純化方法，包括以下步驟：

1、原料及用具的準備

（1）新鮮連翹葉：采新鮮連翹葉,用塑料袋包裹，置于0-4℃冰箱中保存,備用；

（2）研缽和研棒：洗凈用報紙包扎好，121℃滅菌30min，備用；

（3）培養皿、錐形瓶和試管：洗凈用報紙包扎好，121℃滅菌30min，備用；

（4）10ml和1ml移液管：洗凈用報紙包扎好，121℃滅菌30min，備用；

（5）50ml和100ml燒杯：洗凈用報紙包扎好，121℃滅菌30min，備用；

2、培養基及化學試劑的配制

（1）培養基:肉汁胨培養基（BPA）:每1000mL培養基中添加牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g、葡萄糖10.0g和瓊脂18-20g，余量為蒸餾水；0.1MPa，115℃高溫滅菌30min；

肉汁胨液體培養基：每1000mL培養基中添加牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g和葡萄糖10.0g，余量為蒸餾水；0.1MPa，115℃高溫滅菌30min；

（2）化學試劑的配制

濃度為1mol/L的NaOH水溶液：稱取4gNaOH用80mL水溶解，定容至100mL；

7%Hcl：量取70%Hcl10mL，定容至100mL；質量分數為75%乙醇水溶液：量取99%無水乙醇75mL，用無菌去離子水定容至100mL；質量分數為0.1%HgCl₂水溶液：稱取0.1gHgCl₂用80mL水溶解，加水定容至100mL；質量分數為5%NaClO水溶液：量取10%的NaClO50mL，加入定容至100mL；

3、操作方法

（1）稱量并且表面消毒

稱連翹葉片5g，用自來水沖洗干凈，在無菌操作臺上，依次用質量分數為75%乙醇水溶液和質量分數為0.1%HgCl₂水溶液對翹葉片的表面進行消毒5分鐘，再用無菌水漂洗翹葉片4次；

（2）檢驗消毒效果

取最后一次無菌水沖洗液，涂布到BPA平板上，37℃培養3天，檢驗滅菌效果；若發現皿中無菌落出現，證明該葉片表面滅菌徹底，否則該分離結果不能使用；

（3）樣品處理

用滅過菌的剪刀將葉片剪成10mm的正方形，置于研缽中，加15ml無菌水反復研磨搗碎，靜置30min鐘后，用無菌移液管取1ml上清液置于10ml試管中，加水梯度稀釋到濃度為10^-1-10^-4，得到不同濃度的稀釋液；用無菌移液管分別取0.2ml不同濃度的稀釋液涂布于肉汁胨培養基平板上，每濃度涂平皿一個，重復3次，至于37℃溫箱中培養；

（4）純化

培養3-5d后，挑取不同形態的菌落在固體平板上劃線純化，直到分離得到單菌落；

（5）鏡檢

挑取單菌落固定在載玻片上，用革蘭氏染色法進行染色，干燥后，滴加香柏油，在高倍鏡下觀察菌落形態；

（6）保存

挑取鏡檢時所用的單菌落接種于含有BPA液體培養基的三角瓶中，在37℃150r/min搖床中培養12h，至細菌長到對數期，蘸取菌懸液接種于斜面培養基上，37℃培養2d，在試管中觀察到s型的菌種，再轉移到4℃的冰箱中斜面真空冷凍干燥保存，即得到連翹內生細菌LQ-A。