[發(fā)明專利]一種利用非整合質粒載體誘導神經干細胞的方法及其用途

有效

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• 申請日: 2015-09-28
• 公開（公告）號: CN105219729B
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發(fā)明（設計）人: 陳志國;張愚;唐璽和
• 申請（專利權）人: 首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;A61K35/30;A61P25/00;A61P25/16;A61P25/28;A61P3/10;A61P37/02;A61P9/10
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 李敏

本發(fā)明提供了一種利用非整合質粒載體誘導神經干細胞的方法，包括血液中單個核細胞的提取、血液中單個核細胞的擴增、非整合性質粒電轉染、神經干細胞培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明將人外周血中單個核細胞重編程為神經干細胞，可在體外擴增60代以上，表達神經干細胞相關基因，能分化出神經元，星形膠質細胞及少突膠質細胞，其分化的神經元能具有電生理特點，且操作簡單，創(chuàng)傷性極小。

技術領域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，尤其涉及神經干細胞技術領域，具體涉及一種利用非整合質粒載體誘導神經干細胞的方法及其用途。

背景技術

干細胞為許多神經系統(tǒng)疾病治療帶來希望，如帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、老年性癡呆及脊髓外傷性疾病等。研究表明，使用胚胎干細胞治療帕金森病、脊髓損傷及糖尿病有一定作用，但胚胎干細胞的致瘤性，異體移植的免疫排斥以及倫理學爭議限制其應用，進而研究由人成纖維細胞獲得誘導多能干細胞(iPSCs)，并成功建立了治療相關疾病的細胞模型及動物模型。然而研究發(fā)現，iPSCs用于臨床治療還面臨很多問題，如致瘤性，定向分化效率低，安全性問題。神經干細胞(NSCs)是指一類具有自我復制更新能力、高度增殖和多種分化潛能的細胞，在研究神經系統(tǒng)發(fā)育、分化以及治療神經系統(tǒng)疾病中具有重要的作用，因此，將體細胞直接重編程為誘導神經干細胞(induced neural stem cellsiNSCs)，而不經過iPSCs階段，從而減少其致瘤性、提高分化效率，成為現在干細胞研究領域中的研究熱點。

在誘導神經干細胞(iNSCs)的研究中，Kim等使用Dox調控的慢病毒載體系統(tǒng)在小鼠成纖維細胞中轉入Oct4,Sox2,Klf4,C-myc基因，在含有LIF的MEF上培養(yǎng)3-6天后繼續(xù)在神經干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-9天，將會有表達PLZF，PAX6等神經干細胞標志的克隆出現，這種“類似神經干”細胞，可以繼續(xù)分化出星形膠質細胞，神經元，但是此種干細胞在體外只能擴增3-5代。裴端卿等使用非整合質粒載體oriP/EBNA攜帶Oct4,Sox2,Sv40LT,Klf4和microRNA302-367電轉入人尿液中提取的活細胞，然后在神經干細胞培養(yǎng)基中加入CHIR99021，PD0325901，A83-01,Thiazoviv,DMH1，電轉后12天可見神經干細胞克隆出現，且能表Sox1,Sox2,Pax6等神經干細胞標志性基因，誘導的神經干細胞能分化成星形膠質細胞，多巴胺能神經元，谷氨酸能神經元，但是不能自然分化為少突膠質細胞，只有在加用PDGF-AA，NT3等小分子刺激后，才可以分化出少突膠質細胞。張素春等利用仙臺病毒攜帶外源Oct4,Sox2,Klf4,C-myc基因，轉染人成纖維細胞后在含有LIF，SB431541，CHIR99021，的神經干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)13天后有神經干細胞克隆出現，這種誘導的神經干細胞可以分化出神經元，星形細胞，少突膠質細胞。但是，從人體獲取成纖維細胞是有創(chuàng)傷的操作，而且成纖維細胞在轉染前需在體外培養(yǎng)較長時間。而且，老年患者成纖維細胞不容易轉染成功。

由此可見，現有技術中采用病毒載體或質粒載體誘導小鼠成纖維細胞或尿液中提取的細胞時，細胞來源容易受到污染，如從尿液中獲取細胞在操作過程中容易污染，特別是從病房獲得尿液，更加容易污染，操作過程并不簡單，使得神經干細胞誘導的成功率降低，且病毒轉染時可能將外源基因整合到細胞基因組中，導致供體細胞基因突變；此外，誘導得到的神經干細胞體外擴增代數少、且無法自然分化為少突膠質細胞，在移植后無法維持自我更新及多向分化的能力，無法體外快速擴增，體細胞轉分化的周期長、轉分化效率低，數量上無法滿足臨床需求，而不適用于腦神經損傷及脊髓損傷這種并非只是單一神經細胞病變的疾病，數量能夠滿足臨床需求。

發(fā)明內容

因此，本發(fā)明要解決的技術問題在于克服現有技術中誘導的神經干細胞無法體外快速擴增、體細胞轉分化的周期長、轉分化效率低的缺陷，從而提供一種可以體外快速擴增、體細胞轉分化的周期短、轉分化效率高的神經干細胞的誘導方法。