[發明專利]一種對CHH具有結合活性的重組河蟹Esflol蛋白及應用

有效

• 申請號: 201510614828.0
• 申請日: 2015-09-24
• 公開（公告）號: CN105111296B
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 李冉;孫金生;耿旭云;張亦陳;田金澤;朱麗娜
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明公開了一種對CHH具有結合活性的重組河蟹Esflol蛋白及應用，該蛋白具有426個氨基酸，如SEQ ID NO.1所示，編碼的蛋白理論等電點為9.150，分子量為47.18kD；該蛋白具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所對應的基因序列中開放閱讀框（ORF）全長1281bp。實驗結果表明：河蟹肝胰腺組織切片的免疫組化結果進一步印證了這一推斷。而且，基因序列分析顯示Esflol蛋白含有兩個可能的cAMP或cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點，提示Esflol存在參與到cAMP/cGMP介導的信號通路的可能性。結果證明Esflol是CHH調控的信號通路中的一環。對CHH具有結合活性的重組河蟹Esflol蛋白在和CHH特異結合，提升了熟蟹肝胰腺的營養價值和風味。

本研究受到國家自然科學基金青年基金（31302168）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(一般項目)（14JCYBJC30700）；天津師范大學博士基金（52XB1303）的支持。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體是一種對CHH具有結合活性的重組河蟹Esflol蛋白及應用。

背景技術

甲殼動物高血糖激素（CHH），是神經多肽激素家族的成員之一。該蛋白僅存在于節肢動物中，在血淋巴葡萄糖水平調節、蛻皮以及應激過程中起著關鍵作用。雖然細胞膜上的鳥苷酸環化酶（GC）已被公認為Y器官的CHH受體，但在肝胰臟中的受體仍然沒有確定。在本研究中，我們通過對河蟹轉錄組分析，篩選并克隆到了一個在去眼柄后表達量提高了2.8倍的基因—中華絨螯蟹flotilin類似蛋白（Esflol）作為目標分子去研究。通過體外原核表達系統，我們獲得了重組flotilin蛋白。利用CHH與重組flotilin蛋白的Pull-down實驗以及大分子互作儀檢測，我們發現CHH可以和flotilin直接結合。該結果是首次在甲殼動物肝胰腺中發現的CHH結合蛋白，同時表明可以通過體外表達flotilin來調節CHH的濃度。

甲殼動物高血糖素（CHH）屬于CHH神經肽家族。這個家族包含了一類結構相關的多肽，包括蛻皮抑制激素（MIH），卵黃/精巢抑制激素（VIH/GIH），大腭器抑制激素（MOIH）以及離子轉運多肽（ITP）。所有這些成員都只在節肢動物中發現。

學界廣泛認為，CHH是能夠調控幾種生理活性的多效分子，如血糖水平，脂類代謝，蛻皮與應激反應。第一次對CHH的描述是關于其對糖代謝的調控的。肝臟和肌肉是CHH的主要靶標器官，肝臟在蛻皮過程中的所起到的作用是儲存能量，肌肉亦是另一個糖原的儲存場所。學者們認為，CHH在對下游分子的調節機理上在肝臟和肌肉這兩種器官中是明顯不同的。肌肉的糖原只供給其自身，相比之下肝臟所合成與儲存的糖原是供給全身的。

在外界環境的脅迫下，機體中糖原的變化和總碳水化合物的變化總是伴隨著CHH的分泌量的變化。當剪去斑節對蝦和羅氏沼蝦的眼柄后，糖原磷酸化酶明顯下降而糖原合成酶的明顯上升，這預示著去除眼柄能夠促進糖原的積累。另外，肝胰腺在含CHH溶液中的浸泡能夠使得葡萄糖轉化為糖原的比例降低。綜合這些得到的證據表明CHH確實是參與肝臟的糖原代謝的，但CHH的受體以及信號傳導通路還是不明確。在甲殼動物中，已經明確的證實了當減去眼柄之后，肝臟的細胞內cGMP水平會顯著下降，而不是cAMP。也即表明，在甲殼動物中蛋白激酶G替代了蛋白激酶A參與到了CHH介導酶激活系統。但是細胞膜表面直接和CHH作用的分子依然懸而未決。

flotilins被認為是定位在細胞膜表面脂筏（lipid raft）上的連接性蛋白。除此之外，它們能分布在細胞內體，吞噬體，高爾基體甚至細胞核，直到現在，關于flotilins是否只在質膜上存在還沒有定論。