[發明專利]一種檢測人類ABCB1基因多態性的試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201510581614.8
• 申請日: 2015-09-10
• 公開（公告）號: CN105695453A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 徐運;邵淵;張希根
• 申請（專利權）人: 南京仁天生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 南京中新達專利代理有限公司 32226
• 代理人: 孫鷗;朱杰

技術領域

本發明涉及生物醫學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術，特別涉及一種檢測人 類ABCB1基因多態性的試劑盒及其應用。

背景技術

多藥耐藥基因1(multi-drugresistancegene1，MDR1/ABCB1)定位于人類7號染 色體q21.1，其cDNA全長4669bp，由28個外顯子組成，可轉錄得到4.5kb的mRNA，編碼一個 170kDa的跨膜糖蛋白——P-gp。ABCB1基因在人類多藥耐藥基因族中起主導作用，其表達受 各種因素的影響，屬于可調控基因。個體化用藥的概念越來越得到關注，醫學工作者期望通 過基因預測優化個體化治療方案。近年來，ABCB1基因50多處SNP已陸續被發現，而定位在該 基因26號外顯子的rs1045642號SNP位點，其5’末端啟動子的甲基化被看成是ABCB1基因過 度表達的重要因素。通過對ABCB1基因多態性的研究探尋產生耐藥性的可能機制，為基因治 療(如抑制ABCB1基因變異，修復基因缺陷，抑制基因轉錄翻譯成P-gp、P-gp抑制劑等的臨床 應用)提供理論依據。

在本發明作出之前，目前進行基因突變檢測的方法有數十種。金標準法為基因測 序法。基因測序法是目前應用最廣泛、較準確的一種方法，但是該方法需要昂貴的儀器設備 和專業的人員進行操作，費時費力，在臨床上很難進行推廣。基因芯片法具有快速高通量的 優點，但是操作上復雜，步驟多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段長度多態性(RFLP) 檢測基因突變的方法具有成本低廉的優點，但是過程煩瑣，時間長也不適合普及。

發明內容

本發明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種檢測人類ABCB1基因多態性的試劑 盒及其應用。

本發明的技術方案是：

一種檢測人類ABCB1基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其主要 技術特征在于：所述盒體內的物質包括檢測ABCB1基因上的rs1045642號SNP位點的特異性 引物及特異性熒光探針、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、熒光定量PCR反應緩沖液 和去離子水；

所述特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：

正義引物：5’-GTGTCCCAGGAGCCCATC-3’，

反義引物：5’-GCTCCCAGGCTGTTTATTTG-3’；

所述特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：

野生型探針：5’-FAM-AAGAGATCGTGAGGGCA-MGB-3’

突變型探針：5’-HEX-AAGAGATTGTGAGGGCAG-MGB-3’。

所述盒體中各物質的含量為：濃度為10μM的特異性引物共0.45μl，其中正義引物 和反義引物各0.225μl；濃度為5μM的特異性熒光探針共0.2μl，其中野生型探針和突變型探 針各0.1μl；濃度為5單位/μl的TaqDNA聚合酶0.02μl；濃度為20mM的dNTP混合液0.1μl；濃 度為25mM的MgCl2溶液0.5μl；5X熒光定量PCR反應緩沖液2μl；去離子水4.73μl。

所述特異性引物中，正義引物的Tm值為57.1℃，反義引物的Tm值為57.2℃；所述特 異性熒光探針中，野生型探針的Tm值為67℃，突變型探針的Tm值為67℃。

所述試劑盒的保存溫度為-20℃。

本發明的另一技術方案是：

一種檢測人類ABCB1基因多態性的試劑盒的應用，其主要技術物征在于：所述試劑 盒用于檢測ABCB1基因上rs1045642號SNP位點的基因型。

本發明與現有技術相比，優點在于檢測準確性高、檢測簡單方便、檢測時間短、結 果分析簡單的優點，適合臨床實驗室使用：

(1)利用本發明試劑盒能夠對CYP2C19基因多態性位點進行定性檢測，根據SNP位 點進行PCR熒光擴增反應，只需根據兩種不同的熒光曲線是否起線就能進行結果判斷，不會 產生人為誤差，假陽性和假陰性率低，提高效率降低檢測成本。

(2)無需DNA提取，只需裂解全血細胞，將細胞裂解后的懸液加入反應體系即可完 成擴增，免去DNA提取的步驟和成本并避免氣溶膠污染，提高檢測效率和準確度，縮短檢測 時間。