[發明專利]一株利巴韋林單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用

在審

• 申請號: 201510561692.1
• 申請日: 2015-09-07
• 公開（公告）號: CN105087500A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 匡華;彭雙;胥傳來;徐麗廣;馬偉;劉麗強;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

技術領域

一株利巴韋林單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，涉及雜交瘤細胞株1D4及其產生的利巴韋林單克隆抗體。本發明屬于食品安全免疫學檢測領域。

背景技術

利巴韋林為抗病毒藥物，是廣譜強效的抗病毒藥物，由于其毒副作用強，易引起免疫系統損傷和致畸。早在2005年農業部就明確規定禁止利巴韋林等抗病毒獸藥的銷售和使用。

目前檢測利巴韋林的主要方法有儀器檢測方法和免疫檢測方法。儀器檢測方法雖然檢測準確，但儀器昂貴，操作復雜，樣品前處理繁瑣。免疫檢測方法相對于儀器檢測方法，具有低成本、高通量、高靈敏、對技術人員要求低等特點，因此適用于大量樣品的快速篩查。

發明內容

本發明目的在于，第一次提供一株對利巴韋林具有較好親和力和檢測靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備方法。

本發明提供一株利巴韋林單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗體對利巴韋林具有較好的親和力和檢測靈敏度，可以用來建立利巴韋林總量的免疫學檢測方法，或利巴韋林免疫親和柱的制備。

本發明的技術方案：一株利巴韋林單克隆抗體雜交瘤細胞株，其命名為1D4，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.10864。

利巴韋林單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCCNo.10864的利巴韋林單克隆抗體雜交瘤細胞株1D4所分泌產生。

所述的利巴韋林單克隆抗體的應用，用于食品安全中利巴韋林含量的檢測。

本發明提供的細胞株1D4的制備步驟為：

（1）免疫原的制備與鑒定：利巴韋林與丁二酸酐反應后，通過活化酯法與蛋白載體相連，通過透析分離利巴韋林完全抗原和未偶聯的小分子半抗原，并通過蛋白質電泳方法鑒定；

（2）小鼠的免疫：將利巴韋林完全抗原與福氏免疫佐劑^TM混合均勻后，通過背部皮下多點注射免疫BALB/c小鼠。免疫過程總共五次：第一次將利巴韋林完全抗原與福氏完全佐劑混合，后三次用利巴韋林完全抗原與福氏不完全佐劑免疫，最后一次用利巴韋林完全抗原（不含佐劑）沖擊免疫；通過間接ELISA檢測血清效價和抑制；

（3）細胞融合與細胞株建立：通過聚乙二醇（PEG4000）法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養基培養，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株1D4；

（4）雜交瘤細胞株性質的鑒定：抗體亞型的鑒定采用小鼠單克隆抗體亞型試劑盒方法；IC₅₀值、親和力的測定通過ELISA法。

本發明的有益效果：（1）本發明第一次獲得利巴韋林單克隆抗體細胞株，對利巴韋林有較好的檢測靈敏度和親和力，（IC₅₀值為1ng/mL和親和常數為8.04×10⁹L/mol）；（2）通過制備新的抗體的思路，在于用兩種或更多結構相似的半抗原的完全抗原，連續間隔免疫，得到很好的通用型單克隆抗體細胞株。

生物材料樣品保藏：一株利巴韋林單克隆抗體雜交瘤細胞株1D4，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.10864。保藏日期為2015年5月19日。

附圖說明

圖11D4單克隆抗體對利巴韋林的標準曲線。

具體實施方式

本發明下面的實施例僅作為本發明內容的進一步說明，不能作為本發明的限定內容或范圍。下面通過實施例對本發明作進一步說明。

本發明通過將利巴韋林完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，HAT選擇性培養基培養，通過間接ELISA和間接競爭ELISA篩選細胞上清，最終得到了對利巴韋林具有較好親和力和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株。

實施例1：雜交瘤細胞株1D4的制備

1、完全抗原的合成