[發明專利]一種重組胰島素及胰島素類似物前體純化方法

有效

• 申請號: 201510548164.2
• 申請日: 2015-08-31
• 公開（公告）號: CN105153294B
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 張穎;孔凡樓;姜壽俊;劉駿;郭鳳霞;徐丹
• 申請（專利權）人: 濟南康和醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C07K1/18
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• 代理人: 暫無信息

本發明涉及胰島素生產方法領域，公開了一種重組胰島素及胰島素類似物前體純化方法。本發明為解決重組表達的胰島素前體及胰島素類似物前體在純化制備過中存在的常規層析填料因不能耐受高鹽上樣、有機試劑用量大、成本高、產品純度不高的問題，本發明采用以下技術方案：將離心后的發酵液上清經調節pH和離心后，直接上樣經Capto S、Capto MMC、Uni PMM S、Uni MSP中的任何一種填料制備的層析柱進行吸附、分離純化、洗脫，最終得到高純度的重組胰島素及胰島素類似物前體；本發明與現有純化方法相比操作簡單，收率高，耗時短，對環境影響小，可大規模降低現有的胰島素及胰島素類似物的產品生產成本。

技術領域

本發明涉及胰島素生產方法領域，特別涉及一種重組胰島素及胰島素類似物前體純化方法。

背景技術

糖尿病是僅次于心血管和腫瘤的第三大致死疾病，2014年世界糖尿病患者已達3.87億，且每年呈加速上升數目。胰島素是治療糖尿病的特效藥，特別是晚期患者治療時，沒有其它藥物可以代替，隨著糖尿病患者人群不斷擴大及胰島素給藥方式的多樣化增加，胰島素用量正迅速增加。在胰島素的發展過程中，動物胰島素由于免疫原性及瘋牛病和動物口蹄疫等傳播性疾病的蔓延，臨床已逐漸淘汰；以甘精胰島素、門冬胰島素、賴脯胰島素、地特胰島素及德谷胰島素為代表的重組胰島素類似物臨床上已得到廣泛應用，并占據了絕大部分胰島素市場。

隨著重組DNA技術的進展，利用微生物如大腸桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母等發酵平臺，獲得大量的表達胰島素前體成為現實，特別是巴斯德畢赤酵母，它以甲醇作為唯一碳源并采用廉價的BSM培養基進行高密度發酵，高效分泌表達重組蛋白，發酵成本低。但是在畢赤酵母發酵過程中不僅會產生大量色素，而且發酵液中殘留的無機鹽含量非常高，電導率值可達到40-50mS/cm，所以表達的胰島素前體在純化前，必須對發酵上清液進行超濾換液或適當稀釋來降低電導，以便胰島素原可以結合層析填料而實現分離純化。

眾所周知，常規胰島素前體純化方式為采用0.5～1.0M NaCl、pH值為2～4的酸性緩沖液線性梯度洗脫，這種方式得到的人胰島素類似物前體溶液pH為酸性，且存在的大量的Na⁺不僅能抑制酶的活性，而且還需要進行更換緩沖液及除去金屬離子才能進行后續酶切反應，延長生產周期，增加生產成本。

專利CN1699412A中公開的使用常規的陽離子交換柱(SP-fast flow)純化胰島素類似物前體(MIP)，但常規離子交換層析需對樣品大體積稀釋以降低鹽濃度或超濾脫鹽處理后才能進行純化分離，延長了生產周期，增加了生產設備的投入；該專利實施例4中公開了應用XAD-7疏水吸附填料(Sigma公司)分離純化-旋蒸除有機試劑-凝膠過濾(SephadexG25)除去色素和部分多糖，然后利用陽離子交換柱SP-Fast flow(Amersham Biosciences公司)除去多脂類等雜質，收集的胰島素前體(MIP)純度90％以上，其所采用的工藝步驟長、有機試劑消耗大、疏水吸附層析交換容量低、脫鹽步驟產率低，不適合大規模的生產。

專利CN101029077A公開了一種活性炭結合陽離子交換(填料為：SP550EC)、超濾脫鹽的策略純化基因重組胰島素前體，在發酵液直接加入處理后的活性炭，經過攪拌后離心、上清再次經活性炭過濾、透過液經陽離子柱層析、超濾脫鹽、凍干獲得胰島素前體。該工藝步驟也需要對上清液進行透析除鹽，工藝步驟同樣繁瑣，不適合規模化工業生產。

專利CN 102816819 A通過將胰島素類似物前體蛋白依次采用離子交換和反相層析方法純化，但該方案依舊存在前述層析填料不能耐受高鹽上樣，需要對樣品脫鹽處理，因此提出的方案很難應用于規模化工業生產。