[發明專利]一種水稻溫敏不育基因tms5的功能標記及其應用

有效

• 申請號: 201510547897.4
• 申請日: 2015-08-28
• 公開（公告）號: CN105002176B
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 宋豐順;倪金龍;楊劍波;倪大虎;李莉;魏鵬程;李浩;楊亞春;汪秀峰;馬卉;陸徐忠;秦瑞英
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙)11457
• 代理人: 黃云鐸

1.一種用于水稻溫敏不育基因tms5檢測的引物組，其特征在于，所述引物組由第一引物和第二引物構成，所述第一引物中包含錯配堿基，所述第一引物的序列如SEQ ID No.1中所示，所述第一引物的最后一個堿基為錯配堿基；所述第二引物的序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所示，所述引物組能夠通過單次酶切過程來驗證水稻溫敏不育基因tms5。

2.一種利用權利要求1所述的引物組檢驗樣品是否含有tms5基因的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟：

A)提取待檢測水稻樣本的DNA；

B)利用所述第一引物和第二引物對所提取的DNA進行PCR擴增；

C)利用限制性內切酶RsaI酶對所述擴增產物進行酶切；

D)判斷所述限制性內切酶RsaI酶是否能夠將所述擴增產物切開，如果限制性內切酶RsaI酶能夠將所述擴增產物切開，則判定所述待檢測水稻樣本含有tms5基因，否則不含有tms5基因。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟B)中，所采用的聚合酶為rTaq，緩沖液為2×GC buffer II。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟C)中利用限制性內切酶RsaI酶對所述擴增產物進行酶切之前，無需對PCR擴增產物進行純化，直接加入Rsa I酶即可，Rsa I酶的終濃度為1-4U/40μL。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟D)中，判斷所述限制性內切酶RsaI酶是否能夠將所述擴增產物切開的方式為：

(1)如果所采用的第二引物為SEQ ID No.2或SEQ ID No.3中所示的引物，則在對所述擴增產物進行酶切之后，進行PAGE膠電泳，并且根據電泳結果判斷酶切產物中是否缺失了預定長度的片段；

(2)如果所采用的第二引物為SEQ ID No.4中所示的引物，則在對所述擴增產物酶切之后，進行瓊脂糖電泳或者PAGE膠電泳，并且根據電泳結果判斷酶切產物中是否缺失了預定長度的片段。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在對樣品進行檢測時，以含有tms5基因的不育系和常規水稻為對照，并且分別將所述樣品的檢測結果與兩種對照的結果進行對比：檢測的樣品如果帶型和不育系對照一致，說明該樣品含有tms5基因，且純合；如果和常規水稻一致，說明不含有Tms5基因，且純合，不是不育系；如果含有2個對照的條帶，說明所述樣品的基因型為Tms5/tms5。

7.一種利用權利要求1所述的引物組判斷兩系溫敏水稻的種子純度的方法，其特征在于，所述方法包括：以含有溫敏不育基因tms5的不育系和不含tms5基因的材料為對照，對被檢測種子以及所述兩種對照分別按照權利要求3中的所述的方法進行檢驗，如果被檢測種子所檢測出的目的條帶的帶型與含有溫敏不育基因tms5的不育系一致，說明所述被檢測種子含有tms5基因，為溫敏不育系；如果所述被檢測種子所檢測出的目的條帶的帶型與不含tms5基因的材料一致，則所述被檢測種子不含有tms5基因；如果所述被檢測種子含有2個對照的條帶，則所述被檢測種子為雜交種子。

8.一種權利要求1中所述的引物組的應用，其特征在于，所述引物組用于輔助選擇培育新的不育系，所述應用包括將含有tms5基因的不育系與其他水稻品種雜交、回交或自交，利用所述引物組基因按照權利要求2中所述的方法對雜交、回交或自交后代進行檢測，篩選出與所采用的含有tms5基因的不育系的帶型完全一致的純合型單株，即為新的不育系；篩選出Tms5/tms5型可繼續回交或自交。

9.根據權利要求8所述的應用，所述含有tms5基因的水稻是指在離起始密碼子71bp處堿基為A的材料，包括：孟s、新2s、廣占63s、1892s、宣69s、廣茉s、Y58s、P88s、豐39s、安農s-1、N422s、H980S、新安s、深08s、C815s或其同型系及衍生溫敏型核不育系；

不含有tms5基因的水稻是指在Tms5基因外顯子上距離起始密碼子71bp處堿基為非A的材料，包括：農墾58s、7001S、培矮64s、YDs、雁農s、H4s、W6154s、8077s、R1128、R2、WH26、豪恢808、R527、黃化占、鹽稻4號、y80、y59、y28、RH003、揚稻6號或其同型系及衍生系。