[發明專利]一種聚季銨鹽離子液體酶反應器的制備方法

有效

• 申請號: 201510519164.X
• 申請日: 2015-08-20
• 公開（公告）號: CN105112397B
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 鄧啟良;蘇日娜;李燕麗
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;C12N9/76;C12N9/50;C08F226/02
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司12209
• 代理人: 韓曉梅

技術領域

本發明屬于酶反應器技術領域，尤其是一種聚季銨鹽離子液體酶反應器的制備方法。

背景技術

蛋白質組學作為一個多學科的研究，集蛋白質及肽段分離技術、質譜定性及定量分析技術和生物信息學于一體，對復雜多樣的蛋白質的動態變化、結構功能及相互作用進行深入研究。在目前蛋白質組學的研究中，常用的鑒定方法主要為基于質譜的“鳥槍法(shotgun)”。將目標蛋白質酶解后，采用多維液相色譜-質譜聯用技術，對酶解生成的多肽混合物進行分離和質譜分析，并將所產生的數據與其理論蛋白質數據庫進行匹配，從而實現對蛋白質的鑒定。由此可見，蛋白質的規模化鑒定首先需要對樣品進行酶解處理，因此高效快速的蛋白質酶解方法顯得尤為重要，其酶解效率也將成為影響后續蛋白質組及其蛋白質序列深度覆蓋的重要一環。

由于胰蛋白酶、胃蛋白酶是蛋白質組學研究中最常用的蛋白酶，因此被廣泛用于制作酶反應器。已有的研究已經將蛋白酶固定到微型顆粒，膜類載體，整體材料和石英毛細管等多種載體上制作成固定化的酶反應器來提高傳統的溶液酶解效率以及提高酶的利用率。此類酶反應器具有如下優點：(1)單位體積的酶濃度較高，可以縮短酶切時間，提高酶解效率；(2)酶固定在載體上，可以重復利用，降低實驗成本；(3)能夠減少后續質譜鑒定中酶自解產物造成的干擾；(4)可將酶切反應器與分析系統在線連接，實現通量化和自動化。但是，目前，這類酶反應器基質材料的生物相容性差、分散性差，難以重復利用。

通過檢索，尚未發現與本發明專利申請相關的專利公開文獻。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種生物相容性好、可重復利用且分散性較好的聚季銨鹽離子液體酶反應器，該酶反應器可用于對蛋白溶液的酶解，且可以縮短酶解時間、提高酶解效率。

本發明解決其技術問題是采取以下技術方案實現的：

一種聚季銨鹽離子液體酶反應器的制備方法，步驟如下：

⑴在乙腈溶液中加入三乙胺，隨后逐滴加入4-乙烯基芐氯，室溫磁力攪拌2-8小時后，向反應體系中加入乙酸乙酯即可析出白色產物，溶液抽濾后，產物真空干燥后，即得到制備聚離子季銨鹽離子液體酶反應器的功能單體；

其中，所述乙腈溶液與三乙胺的體積比為1:1～4:1，三乙胺與4-乙烯基芐氯的物質的量的比為1:1～1.2:1，所述乙腈溶液與乙酸乙酯的體積比為1：1～1：4；

⑵將步驟⑴的功能單體溶于甲醇中，甲醇做溶劑，然后加入交聯劑、引發劑，功能單體的重量終濃度為1.0％～11.5％，交聯劑的重量終濃度3.5％～30％，引發劑的重量終濃度為0.1％～1.5％，在上述混合后的甲醇液中通入氮氣除氧；

⑶水浴50℃～80℃引發聚合12h～24h后得到固體材料，將固體材料用甲醇洗滌，真空干燥24h，得到白色聚季銨鹽離子液體；

⑷上述步驟⑶得到聚季銨鹽離子液體在Tris-HCl緩沖液中結合蛋白酶，結合完成后的溶液進行離心，離心后的材料用去離子水洗滌后，即得聚季銨鹽離子液體酶反應器。

而且，所述步驟⑴或⑵的功能單體為N-4-乙烯基芐三乙氨基氯鹽；或者，所述真空干燥的時間為24h。

而且，所述步驟⑵的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯，引發劑為偶氮二異丁腈。

而且，所述步驟⑶的甲醇洗滌次數為5次；或者，所述真空干燥的時間為24h。

而且，所述步驟⑷的Tris-HCl緩沖液的pH為6～8。

而且，所述步驟⑷的蛋白酶為胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或木瓜蛋白酶。

而且，所述步驟⑷的去離子水洗滌的次數為3～5次。

而且，用Tris-HCl緩沖液配制0.4mg/mL的蛋白酶溶液，投入白色聚季銨鹽離子液體對胰蛋白酶吸附12h～24h后，得負載蛋白酶的聚離子液體材料，吸附后的溶液離心4000轉/分鐘離心5～10分鐘，棄去上清液，產物用去離子水洗滌，即得聚離子季銨鹽離子液體酶反應器。

本發明的優點和積極效果是：

1、本方法制得的酶反應器生物相容性好，分散性好，酶解效率高，提高酶的利用效率，性能穩定，可以實現重復利用，可以重復利用至少三次，在4℃的環境中放置60天后，仍能用于對蛋白的酶解。

2、本發明方法合成過程簡單，條件易于控制，材料具有較好的熱穩定性，較強的生物相容性，可以用于蛋白的酶解，該酶反應器大大降低了酶解所需時間，提高了酶利用率以及酶解效率，實現了對蛋白更加高效簡便的酶解。