[發明專利]一種利用甘油生產丙烯酸的重組菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201510514412.1
• 申請日: 2015-08-19
• 公開（公告）號: CN105176898B
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 咸漠;童文華;趙廣;劉會洲
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/74;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種利用甘油生產丙烯酸的重組菌及其構建方法與應用，屬于基因工程技術領域。本發明所提供的重組菌是過表達甘油脫水酶基因，甘油脫水酶再激活酶基因，3?羥基丙酰輔酶A脫水酶基因和丙醛脫氫酶基因。本發明的重組菌中構建了以甘油為原料，從頭合成丙烯酸的代謝途徑。同時，本發明還提供了該重組菌的構建方法以及應用方法。本發明以E.coli宿主菌，實現了以甘油為底物，在大腸桿菌這種模式菌株中首次合成得到丙烯酸，為丙烯酸的生產提供了新的技術方法。

技術領域

本發明涉及一種利用甘油生產丙烯酸的重組菌及其構建方法與應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

由于化石能源危機日趨嚴重以及利用化石能源帶來的環境問題，制造生物燃料成為迫切問題。隨著生物柴油的大量生產，產生了大量副產物甘油。據估計，每生產10噸生物柴油大約生成1噸粗甘油。甘油可以作為低廉的可再生原料，用來生產化學品和燃料，可以帶來巨大經濟和環境效益。

丙烯酸(CH2＝CH-COOH)是一個重要的不飽和有機酸和化學工業原料。它可以廣泛的應用在聚凝劑、分散劑、油漆和涂料方面，還能作為皮革、造紙、紡織中的粘合劑。同時，丙烯酸的聚合物，例如超吸水性分子材料的應用，進一步推動了丙烯酸的需求。

丙烯酸可以通過化學合成獲得，但是化學合成途徑具有原料有限、成本居高不下以及容易造成環境污染等問題；與化學合成法相比，生物合成操作簡單、條件溫和、綠色環保。越來越多的科研工作者將研究重點放在了生物合成途徑上。

已知一些微生物可以在代謝中間過程產物微量丙烯酸作為中間體，包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium propionicum)、金屬硫化葉菌(Sulfolobus metallicus)、埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)、橙色綠曲撓菌(Chloroflexus aurantiacus)，布氏酸菌(Acidianus brierleyi)和脫硫弧菌丙烯酸菌(Desulfovibrio acrylicus)等，但是，以上微生物大部分屬于厭氧的無機自養型細菌，難以培養，代謝途徑不清，不易進行生物改造。目前，微生物產丙烯酸的研究主要是利用丙酮丁醇梭菌(Clostridium propionicum)作為宿主菌實現，但是該菌的生物發酵產量低，且不能進行有效改造。同時，現有技術中尚沒有一種以模式菌株大腸桿菌為宿主菌，以甘油為底物生產丙烯酸的重組菌。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種利用甘油生產丙烯酸的重組菌，所采取的技術方案如下：

本發明的目的在于提供一種利用甘油生產丙烯酸的重組菌。該重組菌過表達甘油脫水酶基因，甘油脫水酶再激活酶基因，3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因和丙醛脫氫酶基因。

優選地，所述甘油脫水酶基因，為來源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的甘油脫水酶基因dhaBl23；所述甘油脫水酶再激活酶基因，為來源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脫水酶再激活酶基因gdrAB；所述3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因，為來源于橙色綠曲撓菌(Chloroflexus aurantiacus)的3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因pcsII；所述丙醛脫氫酶基因，為來源于沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的丙醛脫氫酶基因pduP。

本發明的另一目的在于提供一種所述重組菌的構建方法，該方法的步驟如下：

1)克隆獲得甘油脫水酶基因dhaBl23，甘油脫水酶再激活酶基因gdrAB，3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因pcsII和丙醛脫氫酶基因pduP；

2)將步驟1)所得的3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因pcsII和丙醛脫氫酶基因pduP連接到質粒載體上，獲得重組質粒；

3)將步驟1)所得的甘油脫水酶基因dhaB l23和甘油脫水酶再激活酶基因gdrAB插入到宿主菌的丙酸調節子基因prpR座位上，得到宿主重組菌；