[發明專利]一種基于超濾濃縮從大體積孕婦尿液中提取絨促性素粗品的方法

在審

• 申請號: 201510514368.4
• 申請日: 2015-08-21
• 公開（公告）號: CN105085660A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 萬偲;魏超娟;黃朝暉;張素芳;徐富勇
• 申請（專利權）人: 江西浩然生物醫藥有限公司
• 主分類號: C07K14/59
• 分類號: C07K14/59;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發明屬于生物技術提取天然藥物，具體涉及一種基于超濾濃縮從大體積孕婦尿液中提取絨促性素粗品的方法。

背景技術

絨促性素（ChorionicGonadotrophin）又稱人絨毛膜促性腺激素（HumanChorionicGonadotrophin），簡稱HCG，1927年由Aschhein和Zondek從孕婦尿中發現，絨促性素是由胎盤的滋養層細胞分泌的一種糖蛋白，主要存在于懷孕婦女的尿和血液中。

絨促性素是由α和β二聚體的糖蛋白組成的一種激素，其α亞基和β亞基通過非共價疏水和離子的相互作用結合在一起，絨促性素的分子量大約為32KD，其分子量的25%-41%來自于糖側鏈（常規的絨促性素為25%-30%，高糖基化的絨促性素為35%-41%），α亞基有92個氨基酸殘基，β亞基有145個氨基酸殘基。

絨促性素是胎盤滋養細胞分泌的一種促性腺激素，在受孕后10-14天開始分泌，在妊娠最初3個月，HCG水平每2.2天月升高一倍，以維持妊娠。非孕婦尿液中HCG一般小于25IU/L，孕40天尿液中HCG含量大于5000IU/L。

絨促性素對雌性能促使卵泡成熟及排卵，并使破裂卵泡轉變為黃體，促使其分泌孕激素。對雄性則具有促間質細胞激素的作用，能促進曲細精管功能，特別是睪丸間質細胞的活動，使其產生雄激素，促使性器官和副性征發育、成熟，促使睪丸下降并促進精子生成。臨床上主要用于促進排卵，治療不孕不育，以及妊娠早期先兆流產、習慣性流產以及低促性腺功能減退癥，近期研究表明絨促性素可以用來治療癌癥等。

絨促性素粗品的傳統制備方法為收集孕婦尿液在尿液中直接加入苯甲酸鈉，再加入鹽酸反應生成苯甲酸，吸附絨促性素等尿蛋白，再加入酒精使蛋白沉淀，收集HCG沉淀，干燥。該方法的缺點在于原尿體積太大，苯甲酸鈉吸附率低，為保障充分吸附往往加入過量苯甲酸鈉（一般為原尿液量的2-3%左右），且反應時間長需要攪拌吸附至少2小時，該過程中HCG容易發生降解；原尿中水分較多，調pH時需要浪費大量鹽酸。

CN103193880A公開的方法，采用超濾濃縮方法將尿液濃縮至原重量4-5%，加入少量無水氯化鈣后直接用丙酮沉淀，對目標蛋白的沉淀效率低，產品收率僅為40%左右；另外由于尿液中雜蛋白很多，該方法容易將尿液中各種雜質蛋白沉淀下來，得到的產品單位活性低，不利于后續的HCG純化操作。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種基于超濾濃縮從大體積尿液中提取絨促性素粗品的方法。通過超濾濃縮，減少試劑的使用量，同時液體濃縮后進行吸附大大提升吸附效率，提高產品的活性收率。

本發明是這樣來實現的，方法步驟為：

a.收集新鮮孕婦尿液，冷卻至溫度2-8℃后用截留分子量10kDa超濾膜進行濃縮，濃縮至原尿液體積的10%；

b.向a中濃縮液加入6-8%的苯甲酸鈉后，攪拌15-30分鐘至苯甲酸鈉完全溶解；

c.向b溶液中加入鹽酸調pH至3.8-4.0，溫度2-8℃下繼續攪拌30-60分鐘，析出大量白色不溶物，溶液變成白色懸濁液；將該懸濁液灌入濾布袋中，過濾收集白色不溶物，甩干；

d.向不溶物中攪拌加入2-8℃預冷過的食用酒精（v/w95%）直至酒精終濃度為80%，溶液中析出大量白色絮狀沉淀，將該沉淀在2-8℃下靜置8-12小時；

e.虹吸去除e中的上清液，真空抽濾收集沉淀，并用丙酮脫水2-3次，減壓干燥得到人尿絨促性素粗品。

本發明的技術效果是：本發明的方法較傳統工藝比具有濃縮后提取效率高；苯甲酸鈉和鹽酸用量僅為原用量的三分之一，降低了生產成本；尿液濃縮后水分大大減少，液體中絨促性素蛋白濃度增加，更利于絨促性素與苯甲鈉結合，產品活性收率提高近一倍，高達80%以上，得到粗品單位活性大于10IU/mg，比活性大于15IU/mg.pr。

具體實施方式

實施例1一種基于超濾濃縮從大體積孕婦尿液中提取絨促性素粗品的方法，步驟如下：