[發明專利]一種基于深孔板的衣康酸高產菌株的高通量篩選方法及菌株

在審

• 申請號: 201510475563.0
• 申請日: 2015-08-05
• 公開（公告）號: CN105087390A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 楊靜;蔣劍春;衛民;張寧;趙劍
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院林產化學工業研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N15/01;C12N13/00;C12R1/66
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馮慧

技術領域

本發明涉及微生物菌種篩選技術領域，尤其是一種基于原生質體誘變、深孔細胞培養板的高通量篩選衣康酸高產菌株的方法。

背景技術

衣康酸學名為甲叉琥珀酸、亞甲基丁二酸，是世界上第五大有機酸。由于分子內存在一個不飽合雙鍵和兩個活潑的羧基,使得衣康酸能夠進行加成、聚合反應,形成聚合高分子,其中尤其重要的是衣康酸的酯化反應。標準的酯化反應能夠產生衣康酸二酯,且產率很高。衣康酸酯類是合成樹脂、塑料、增塑劑的重要原料；另外,衣康酸與胺類反應生成的N-烴基吡咯烷酮是一類重要的化合物。衣康酸及其酯類是生產腈綸等化纖、合成樹脂、塑料、橡膠、藥物、表面活性劑、無毒食品包裝材料、除草劑、除垢劑、粘著劑等工業原料,廣泛用于化工行業。

衣康酸的生產方法有化學合成法、檸檬酸分解法和微生物發酵法。其中微生物發酵法由于原料來源廣泛、成本低、生產條件溫和，是目前國內外生產衣康酸的主要方法。在衣康酸的生產過程中，如何快速高效地獲得高產菌株至關重要。目前，衣康酸生產菌種主要有屬于土曲霉群的土曲霉(Asp.terreus)和屬于灰綠曲霉群的衣康酸曲霉(Asp.itaconicus)。實際生產中應用最多的是土曲霉，但是Asp.terreus野生菌株一般產量都很低，因此運用誘變育種的方法來獲得高產菌株的研究日益增加。而誘變后菌種篩選工作量巨大而效率非常低，是目前制約工業微生物生產發酵的重要因素。高通量篩選技術，由于具備微量、高效、靈敏、準確、可重復等特點，成為微生物篩選的主要技術手段。目前還未見適合篩選衣康酸高產突變株的高通量篩選方法的相關報道。

本研究旨在建立一種高效快速篩選衣康酸高產菌株的高通量篩選方法。通過誘變育種，結合高通量方法篩選衣康酸高產菌株，既可以提高工作效率，降低成本，又能大幅度提高篩選速率。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于深孔板的衣康酸高產菌株的高通量篩選方法及菌株。

本發明的技術方案為：一種衣康酸高產菌株，為土曲霉(Aspergillusterreus)，保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.11039，保藏日期為2015年7月2日。

一種權利要求1所述的衣康酸高產菌株的基于深孔板的高通量篩選方法，包括菌株的原生質體誘變；選擇性平板初篩；基于深孔細胞培養板的高通量篩選；搖瓶復篩及遺傳穩定性考察，具體步驟為：第一步，菌株的原生質誘變：菌株培養后過濾滲透壓穩定劑沖洗得到的菌絲體，收集菌絲體移入無菌三角瓶內加入酶液酶解，過濾去除菌絲片段，離心收集原生質體，滲透壓穩定劑清洗后重懸于滲透壓穩定劑中；然后對得到的原生質體進行誘變得到原生質體液；所述的原生質體誘變采用方法為紫外線誘變、DES誘變或者超聲波誘變中的任一種；

第二步，選擇性平板初篩：利用滲透壓穩定劑配制再生培養基，上層平板液事先放入40～45℃水浴中保溫，將原生質體液加入上層平板液混勻，快速傾倒在已凝固的下層再生平板上，倒置，培養箱溫度35～37℃，培養3～5d；平板的篩選因素為：溴甲酚綠、高糖、代謝產物衣康酸或代謝前體琥珀酸中任意一種；

第三步，基于深孔細胞培養板的高通量篩選：挑取再生平板單菌落挑至裝有1.2～2.0mL發酵培養基的深孔板中，在150～250r/min下，振蕩培養2～4d，離心，取上清液測衣康酸含量，同時一一對應地接至裝有固體斜面培養基的深孔板中，于25～28℃恒溫培養3～5d,用板封口膜密封,4℃冰箱保存；根據測定結果挑選菌株進行搖瓶復篩；

第四步，搖瓶復篩及遺傳穩定性考察：將挑選出要進行搖瓶復篩的菌株從斜面培養基中對應的菌落接種至含種子培養基的搖瓶中，搖床培養得到種液，進行搖瓶復篩；搖瓶復篩的條件為：接種量5％～10％，35～37℃，150～250r/min搖床培養3～5d；連續傳代培養5代，考察遺傳穩定性，篩選得到最穩定的菌株。

第一步中所述的酶液為：纖維素酶4～8mg/ml，蝸牛酶2～4mg/ml，溶菌酶0.5～1.5mg/ml的混合酶。

所述的滲透壓穩定劑為0.4～0.65mol/L的NaCl水溶液。