[發明專利]一種基于深孔板的衣康酸高產菌株的高通量篩選方法及菌株

在審

• 申請號: 201510475563.0
• 申請日: 2015-08-05
• 公開（公告）號: CN105087390A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 楊靜;蔣劍春;衛民;張寧;趙劍
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院林產化學工業研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N15/01;C12N13/00;C12R1/66
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 馮慧

1.一種衣康酸高產菌株，其特征在于，為土曲霉(Aspergillusterreus)，保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.11039，保藏日期為2015年7月2日。

2.一種權利要求1所述的衣康酸高產菌株的基于深孔板的高通量篩選方法，其特征在于：包括菌株的原生質體誘變；選擇性平板初篩；基于深孔細胞培養板的高通量篩選；搖瓶復篩及遺傳穩定性考察，具體步驟為：第一步，菌株的原生質誘變：菌株培養后過濾滲透壓穩定劑沖洗得到的菌絲體，收集菌絲體移入無菌三角瓶內加入酶液酶解，過濾去除菌絲片段，離心收集原生質體，滲透壓穩定劑清洗后重懸于滲透壓穩定劑中；然后對得到的原生質體進行誘變得到原生質體液；所述的原生質體誘變采用方法為紫外線誘變、DES誘變或者超聲波誘變中的任一種；

第二步，選擇性平板初篩：利用滲透壓穩定劑配制再生培養基，上層平板液事先放入40～45℃水浴中保溫，將原生質體液加入上層平板液混勻，快速傾倒在已凝固的下層再生平板上，倒置，培養箱溫度35～37℃，培養3～5d；平板的篩選因素為：溴甲酚綠、高糖、代謝產物衣康酸或代謝前體琥珀酸中任意一種；

第三步，基于深孔細胞培養板的高通量篩選：挑取再生平板單菌落挑至裝有1.2～2.0mL發酵培養基的深孔板中，在150～250r/min下，振蕩培養2～4d，離心，取上清液測衣康酸含量，同時一一對應地接至裝有固體斜面培養基的深孔板中，于25～28℃恒溫培養3～5d,用板封口膜密封,4℃冰箱保存；根據測定結果挑選菌株進行搖瓶復篩；

第四步，搖瓶復篩及遺傳穩定性考察：將挑選出要進行搖瓶復篩的菌株從斜面培養基中對應的菌落接種至含種子培養基的搖瓶中，搖床培養得到種液，進行搖瓶復篩；搖瓶復篩的條件為：接種量5％～10％，35～37℃，150～250r/min搖床培養3～5d；連續傳代培養5代，考察遺傳穩定性，篩選得到最穩定的菌株。

3.根據權利要求2所述的所述的衣康酸高產菌株的基于深孔板的高通量篩選方法，其特征在于，第一步中所述的酶液為：纖維素酶4～8mg/ml，蝸牛酶2～4mg/ml，溶菌酶0.5～1.5mg/ml的混合酶。

4.根據權利要求2所述的所述的衣康酸高產菌株的基于深孔板的高通量篩選方法，其特征在于，所述的滲透壓穩定劑為0.4～0.65mol/L的NaCl水溶液。

5.根據權利要求2所述的所述的衣康酸高產菌株的基于深孔板的高通量篩選方法，其特征在于，第三步所述的發酵培養基配方為：葡萄糖60～100g/L，(NH₄)₂SO₄1～5g/L，MgSO₄.7H₂O1～3g/L，KH₂PO₄1～3g/L，FeSO₄·7H₂O0.02～0.05g/L，ZnSO₄·7H₂O0.01～0.1g/L，玉米漿1～3g/L，調節pH3.0-3.5；固體斜面培養基配方為PDA培養基。

6.根據權利要求2所述的所述的衣康酸高產菌株的基于深孔板的高通量篩選方法，其特征在于，所述的紫外線誘變法為：吸取單孢子懸浮液5～8mL，加入到放于磁力攪拌器上的直徑9cm的培養皿中，在15～20cm的距離下用15～20W的紫外燈照射50～200s。邊攪拌邊照射，使孢子均勻的吸收紫外線光波。

7.根據權利要求2所述的所述的衣康酸高產菌株的基于深孔板的高通量篩選方法，其特征在于，所述的DES誘變法為：用0.1～0.2mol/L的磷酸緩沖液，pH值5～8，分別配置體積分數為0.5～2.5％的DES溶液，各取以上DES溶液和菌懸液等量加入到無菌試管內混勻，室溫振蕩處理5～10min，誘變處理結束后加入0.5～1mL、1～2％wt的NaS₂O₃終止反應。

8.根據權利要求2所述的所述的衣康酸高產菌株的基于深孔板的高通量篩選方法，其特征在于，所述的超聲波誘變法為：用移液槍移取2～4mL菌懸液，置于滅好菌的無菌離心管中，運用超聲波細胞粉粹機,采用150～200W的功率，分別作用5～60min。